低氧环境调控下的骨髓间充质干细胞改善胰岛移植物功能的实验研究

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1、f／lliltIf[／rl[／fllF[IfY1713858Author’ssignature：一‘■‘Nupervisor7ssignature：Thesisreviewer1：Thesisreviewer2：Thesisreviewer3：Thesisreviewer4：Thesisreviewer5：W沁y仉U觚Committeeman3：，●Committeeman4：Committeeman5：Dateoforaldefence：M型2Q!Q“q浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学

2、位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝塑太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：蜘‘年6月7日厂学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝塑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数

3、据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：c：渤年彳月)日导师签名：签字日期：浙江大学博士学位论文致谢致谢时光飞逝，转眼即将毕业，回顾三年求学生涯，导师的教诲、同学的关怀、实验中一次次失败的痛苦和成功的喜悦都历历在目。此时此刻，心中的无限感慨只能化为平实的文字，向在我完成学业过程中给予我帮助的所有人表示衷心的感谢。首先感谢我的导师吴育连教授。三年来，从生活到学习，从临床到科研，从课题选择到论文完成，我取得的每

4、一点进步都离不开她的关怀和教诲，在此致以诚挚的谢意和崇高的敬意。特别感谢我的师姐谢秋萍，博士实验的整体设计以及其中的移植实验都是在她的亲手指导和协助下完成的，对此我无比感激。同时感谢我的其他师兄弟在我的实验和学>--j中给予的帮助。还要感谢浙一医院动物实验中心鱼达老师，工作人员李辉、何勇、陈辉和姜骊在动物实验中给予的帮助。尤其要感谢我的家人，是他们一如既往的理解和支持给了我克服困难的信心和勇气，激励我努力完成艰苦的学业。最后感谢所有帮助过我的人，谢谢你们。≮’，●浙江大学博士学位论文摘要低氧环境调控下的骨

5、髓间充质干细胞改善胰岛移植物功能的实验研究浙江大学医学院博士研究生导师外科学(普外)金晓立吴育连教授中文摘要研究背景：糖尿病是人类健康与生命安全的一大威胁，其发病率近几年来呈不断上升趋势，预计中国糖尿病人数到2025年将达3760万，跃居世界第一。1型糖尿病与自身免疫相关，通过免疫反应破坏胰岛D细胞，导致胰岛素分泌不足，对外源性胰岛素依赖严重，常出现严重的并发症。尽管丰富便捷的胰岛素制剂为1型糖尿病患者的血糖控制提供了很大帮助，但仍然面临着胰岛素抵抗和致死性低血糖的风险，同时对血糖的调控缺乏及时性和精确性

6、。胰岛移植重建内源性血糖调控系统是克服上述缺点彻底治愈1型糖尿病的理想方案。免疫损伤以及缺血缺氧等引起的移植物原发性无功能是目前胰岛移植所面临的最大障碍。本研究的目的是寻找一种保护移植胰岛，降低移植物原发性无功能的方法，以提高移植的成功率。骨髓间充质干细胞是一类多能干细胞，它具有无限增殖、多向分化的能力。组织工程学上常用它作为修补缺损、弥补功能的种子细胞。它是造血微环境的重要组成部分，能够强烈地刺激造血，促进血管新生。同时它能合成多种活性细胞因子，通过旁分泌作用亍其它细胞，保护目的细胞。并且在低氧环境的刺

7、激下，浙江大学博士学位论文摘要其增殖、分化和分泌功能都有不同程度的增强。我们的研究设想通过原代分离得到骨髓间充质干细胞，利用低氧刺激增强骨髓间充质干细胞的活性，与原代分离得到的胰岛于体外辅助培养、体内联合移植，以探讨其作为胰岛移植的辅助支持细胞的有效性和可行性。为克服移植物原发性无功能和供体紧缺的困难提供一定的理论依据。第l章：小鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养及鉴定目的：建立小鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化及培养的方法，并鉴定其生物学特性。方法：通过全骨髓贴壁法得到含杂细胞的骨髓间充质干细胞后，通

8、过特殊培养基选择性优势生长后纯化骨髓间充质干细胞；通过MTT法建立其生长曲线；通过流式鉴定其表面CD标志；并通过特殊成脂肪分化培养基鉴定其分化能力。结果：大部分细胞于24h内贴壁，传代3代以上后形态趋于一致，呈成纤维细胞样。细胞大致4天为一个生长高峰，第3代子细胞和第6代子代细胞在生长速度上有差异。子1代小鼠骨髓问充质干细胞表面CD29和CD71阳性，CD34阴性，CD45弱阳性，CD90阴性。传代后，CD29和CD71阳性率