家蚕二氢硫辛酰胺脱氢酶基因的分子克隆与其鉴定

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1、江苏大学硕士学位论文摘要二氢硫辛酰胺脱氢酶是一种广泛存在于各种生物并在能量代谢中起重要作用的黄素氧化还原酶。目前，人们已经鉴定了多种生物的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因，但是还没有与家蚕二氢硫辛酰胺脱氢酶基因相关的报道。本论文通过利用实验和生物信息学方法得到了家蚕二氢硫辛酰胺脱氢酶基因，并对其进行了初步分析和鉴定。从NCBI中搜索得到了家蚕二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamidedehydrogenase，DLDH)基因并利用生物信息学软件进行分析。结果表明，该基因含有11个外显子和10个内含子，开放阅读

2、框长1491bp，编码496个氨基酸，预测分子量为52．9kDa，等电点为8．8，并在N一末端含有一个27个氨基酸残基的线粒体定位信号序列。设计引物扩增出了其编码序列，克隆并利)羽pET．28a表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)qb进行了表达，得到了分子量约为56KDa的融合蛋白，经质谱和WesternBlotting鉴定蛋白氨基酸序列正确。蛋白经Ni—rCrA纯化系统纯化后用于免疫新西兰大白兔，制备抗家蚕DLDH蛋白的血清。RT．PCR对家蚕不同发育阶段和组织检测结果表明，DLDH在家蚕各个发育阶段和幼虫

3、不同组织都有表达。提取五龄幼虫各组织蛋白进行Westemblotting分析，结果证实DLDH在各组织都有表达。免疫荧光和亚细胞器的WesternBlotting实验显示家蚕DLDH蛋白主要定位在线粒体中。二氢硫辛酰胺脱氢酶利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸江苏大学硕士学位论文NAD+(nicotinamicleadeninedinucleotideWADH作辅酶，可逆催化硫辛酰胺和二氢硫辛酰胺相互转变。利用这一特性，测定了非变性纯化条件下纯化的大肠杆菌中表达的重组家蚕DLDH纯化的酶活性。体外实验表明，原核表达的重组

4、家蚕DLDH蛋白具有依赖于硫辛酰胺氧化NADH的酶活性。关键词：家蚕，二氢硫辛酰胺脱氢酶，生物信息学分析，RT—PCR，亚细胞定位，酶活II江苏大学硕士学位囊文ABSTRACTDihydrolipoamidedehydrogenase(DLDH)，aflavin—dependentoxidoreductase，isanubiquitousenzymewhichpresentsinvarietyoforganismsandplaysanimportantroleinenergymetabolism．Todate

5、，DLDHhavebeenidentifiedinmanyspecies，however，noreportshavebeenpublishedonDLDHinBombyxmori(BmDLDH)．Inthisstudy，weobtainedtheBmDLDHcDNAsequencefromNCBIandperformedbothbioinformaticsandexperimentanalysisonBmDLDHgene．TheresultsshowedthatBmDLDHgenecontained1exon

6、sand10introns，andthecDNAofthegenecontainedanopenreadingframe(ORE)of1491bp，encodingaproteinof496aminoacidresidueswiththeoreticalmolecularmassof52．9kDa，theoreticalisoelectricpointof8．8．Thereisamitochodriatargetingpeptide(MTP)composedof27aminoacidsattheN—termi

7、naloftheprotein．Inthepresentstudy，theputativegenewascloned，expressedinE．coliBL21(DE3)andpurifiedbymetalchelatingaffinitychromatographyunderbothnatureanddenatureconditions．Theaminoacidssequenceofrecombinantproteinwasconfirmedbymassspectrographicanalysisandth

8、epurifiedrecombinantproteinwasusedtoanalyzeenzymeactivityandtoraisepolyclonalantibodyagainstBmDLDHforsubcellularlocalizationstudyandproteinexpressionpatternanalysis．ReversetranscriptionIII江苏大学硕士学位论文pol