干细胞联合血红素加氧酶1和心肌营养素1基因治疗急性心肌梗死研究论文

《干细胞联合血红素加氧酶1和心肌营养素1基因治疗急性心肌梗死研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、干细胞联合血红素加氧酶．I和心肌营养素-1基因治疗急性心肌梗死的研究中文摘要中又捅要目的：探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合血红素加氧酶．1(HO．1)和心肌营养素．1基因(CT01)治疗急性心肌梗死改善心功能。方法：(1)Trizol试剂法从大鼠脾脏细胞中提取总RNA，经RT-PCR反应克隆扩增HO．1基因，与PIRES2一EGFP载体链接，．构建重组真核表达载体PIRES2．EGFP／HO。1；PIRES2．EGFP／CT-1表达载体为本实验室构建保存。(2)采用全骨髓培养法体外分离培养大鼠BMSCs，观察生长特性、抗原表达等特征，MTT计数法检测其体外增殖能力。(3)用质粒

2、大量抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行定量；将制备好的白蛋白微泡与质粒DNA轻柔混匀，4℃静置1h，滴加入培养液中，以直径为20mm的超声探头采用0．75W／cm2脉冲超声作用细胞20sec，37℃放置5min后以同样的条件再次作用细胞，6h后更换新鲜的完全培养基继续培养48h，在荧光显微镜下观察EGFP的表达，流式细胞仪定量分析转染效率；转染后的细胞经台盼蓝染色检测细胞活性。(4)大鼠麻醉后，开胸结扎左冠状动脉，建立大鼠心肌梗死模型并以心电图、超声心动图和血清肌钙蛋白T的检测来判定。(5)将成功建立的大鼠心肌梗死模型40只随机分为四个治疗组：①对照组(BMScs组，注射BMSCs至心

3、肌梗死周边组织)，n=10；②转染HO．1基因的BMSCs注射组(HO．1+BMSCs组，注射转染HO-l基因的BMSCs至心肌梗死周边组织)，n--10；③转染CT-1基因的BMSCs注射组(CT-1+BMSCs组，注射转染CT-1基因的BMSCs至心肌梗死周边组织)，n--10；④两种转基因BMSCs注射组(HO．1+CTol+BMSCs组，注射两种转基因BMSCs至心肌梗死周边组织)，n=10；术后20天，进行心脏超声检测以及统计学分析来评估疗效。(6)取其心脏取结扎线以下部分，固定、脱水、包埋、切片，HE染色，进行病理组织学观察；心肌组织冰冻切片后直接于荧光显微镜下观察，寻找

4、表达EGFP的移植细胞。结果：(1)从大鼠脾脏细胞中扩增获得HO．1基因，构建真核表达载体PIRES2．EGFP／HO．1，测序正确的阳性克隆保种备用。(2)由骨髓分离得到的BMSCs呈梭形贴壁生长，台盼蓝染色显示活细胞率>95％；MTT生长曲线显示，细胞在干细胞联合血红素加氧酶-l和心肌营养素-l基因治疗急性心肌梗死的研究中文摘要．接种后第3d即进入对数生长期，细胞增殖活跃；运用流式细胞仪检测显示该群细胞高表达CD29(97．6％)，CD44(96．5％)，CD90(98．2％)，低表达CD34(3．7％)，CD45(6．8％)分子。(3)制作的白蛋白微泡浓度大于1．5×1011个

5、加l，直径为2．O．4．0岬；超声作用细胞后经台盼蓝染色法检测细胞存活率>95％；转染48h后的BMSCs在激光共聚焦显微镜下可观察到EGFP，流式细胞仪检测转染细胞EGFP的表达效率为30．8％；转染后的细胞提取RNA，进行RT-PCR检测目的基因的表达发现，转基因组有特异性的条带，而对照组未见特异性条带。(4)心肌梗死动物模型建立后心电图ST段抬高，超声心动图可见明显的心梗区域，手术前后心功能指标统计学有显著差异；梗死后24h的血样本肌钙蛋白T检测阳性。(5)心肌梗死治疗后20d，超声心动图各项心功能指标进行统计学分析，结果显示：各转基因BMSCs组与对照组比较，P<0．05；转

6、染HO．1基因和CT-1基因的BMSCs治疗组之间比较，P>0．05；两种转基因BMSCs治疗组与转染HO．1基因和CT-1基因的BMSCs治疗组之间比较，P<0．05。(6)细胞移植后20d，心肌组织病理切片显示，正常心肌细胞有横纹，呈短圆柱型，有分支，其细胞核位于细胞中央，一般只有一个。梗死心肌组织可观察到明显的凝固性坏死区域，细胞核碎裂、溶解、消失，胞浆均质红染，间质水肿，周围有大量的炎性细胞浸润。各治疗组大鼠心肌梗死区及周边可见核蓝色深染的新生心肌细胞，瘢痕组织减少。(7)移植细胞后的心肌组织冰冻切片直接于荧光显微镜下观察，可见有少量细胞微弱表达EGFP。结论：骨髓间充质干细

7、胞具有自我更新及多向分化的潜能，取材方便，且自体应用时无免疫排斥性，是一种良好的心肌修复种子细胞。超声介导自蛋白微泡破裂法可以有效地促进外源基因的转染。运用结扎冠状动脉法建立大鼠心肌梗死模型，方法简单可靠。移植两种转基因的BMSCs较单纯移植BMSCs对心肌梗死的大鼠心功能有明显改善，两种转基因细胞联合移植治疗效果更佳。关键词：急性心肌梗死；血红素加氧酶．1；心肌营养素一1；骨髓间充质干细胞；白蛋白微泡；超声；大鼠研究生：张燕指导老师：李肖蓉教授张学光教授