急性心肌梗死研究论文

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1、急性心肌梗死研究论文急性心肌梗死研究论文急性心肌梗死研究论文急性心肌梗死研究论文　　[论文关键词]心肌梗死；内皮祖细胞；CXCR4　　[论文摘要]目的观察急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)患者外周血来源内皮祖细胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)CXCR4受体表达及功能的变化。方法选择AMI患者15例，对照组非AMI患者15例，抽取外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7d后对贴壁的细胞进行分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝集素I和

2、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为EPCs。应用改良的Boyden小室测定EPCs对基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-I)的迁移能力，流式细胞仪测定EPCs的CXCR4的表达，RT-PCR法测CXCR4的mRNA表达。结果AMI患者外周血EPCs数目增多，对SDF-1的迁移能力增强，其表达CXCR4上调，CXCR4的mRNA合成增强。与对照组相比，差异均具有统计学意义(P　　众多证据表明，循环中内皮祖细胞(endothelialprogentiorce

3、lls，EPCs)在成体血管形成中起了重要作用。动物和临床实验均表明，静脉注射EPcs，能显著促进缺血组织的血管新生及功能恢复，而同样条件下注射成熟内皮细胞却收效甚微。这些均表明了EPcs在机体生理或病理情况下对血管形成的重要作用。因而EPcs也成为研究的热点。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的EPcs，参与维持血管壁的完整性。但冠心病人的EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与冠心病的危险因素呈相关性。作为冠心病的一种特殊类型急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)，在急

4、性期由于存在自体骨髓动员现象，EPCs却是升高的。但升高后的EPCs功能如何，少有报道。笔者研究了AMI急性期EPCs的CXCR4受体的变化，来试图解释其功能的变化，以期为提高EPCs治疗效果提供一种新的思路。　　1资料与方法　　1．1一般资料　　AMI患者15人，对照组为因非典型胸痛而行冠状动脉造影并排除冠心病的患者15人，2组临床资料。排除近期内有炎症、肿瘤、手术及合并糖尿病，服用雌激素、他汀类药物等影响EPCs因素的患者。　　1．2材料与试剂　　淋巴细胞分离液(相对密度)购自上海生化试剂二厂；EGM-2-MV

5、内皮细胞培养基购自Clonetic公司；胎牛血清(Fcs)购自GIBCO公司；人纤维连接蛋白购自Chemicon公司；FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)购自Sigma公司；基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)、FITC标记的抗CXCR4抗体购自深圳晶美生物公司；改良的Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒、TaqDNA聚

6、合酶和dNTP购自Fermcntas公司。引物由北京奥科公司合成。　　1．3方法　　1．3．1EPCs的分离、培养与鉴定每例患者取外周血15ml，分别常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板。加入EGM-2-MV培养基及5％FCS于5％CO培养箱中37℃恒温培养。培养4d后，用PBS洗掉非贴壁细胞。为了维持细胞原先生存环境，换为EGM-2-MV培养基，加入20％的细胞来源患者血清，继续培养至7d后进行各种检查分析。贴壁细胞用DiI-acLDL、F

7、ITC-UEA-I行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择15个视野(×200)对EPCs计数。取其平均值换算成每平方毫米的细胞个数记录。　　1．3．2EPCs对SDF-l的迁移能力检测用胰酶消化贴壁细胞并计数。将含SDF-1质量浓度浓度为100ng/ml的培养液(EGM＋20％患者血清)30μl注入改良的Boyden小室的下室，将含3×10个EPCs的培养液(同上)50μl注入上室，培养5h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个

8、显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。　　1．3．3流式细胞术分析消化后的部分EPCs离心，沉淀重悬于PBS中，取约5×105细胞，加入FITC标记的抗CXCR4抗体及同型对照，于流式细胞仪(FACSCalibur，B－D公司)上进行阳性细胞记数，每次分析获取10个细胞。　　1．3．4RT-PCR检测应用Trizol提取上述收集的EPCs总RNA，测定