间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的研究

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1、硕士学位论文问充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的研究硕士研究生：李明指导教师：蔡德鸿教授摘要研究背景胰岛移植重建胰岛素分泌系统，是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年，Edmonton方案的成功，标志着胰岛移植取得了突破性的进展，从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。目前普遍认为，解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂，尽管诱导免疫耐受的方法众多，但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。持久耐受状态的诱导需要稳定混合嵌合状态的长期维持，是在移植受体内供体来源的细胞和受体细胞的共存。在啮

2、齿类动物体内通常通过中枢删除机制达到混合嵌合状态，使能够维持长期的器官移植免疫耐受。然而传统的骨髓细胞输注仍然无法在人体内实现有效的混合嵌合状态，且非特异性免疫抑制剂的应用，移植物功能的慢性丧失以及潜在致命性的移植物抗宿主反应的发生，这些因素均限制着通过骨髓细胞嵌合体来达到器官移植耐受的临床的应用。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)可以从成熟的骨髓、脂肪组织、胎盘、头皮和多种胎儿组织中获得，具有向骨组织、软骨和脂肪等的多能分化潜能。在体外实验中还发现MSC在特定的培养条件下能够向肌肉、肝细胞、内皮细胞和神经组织等分化，骨髓间充质干细胞体外培养条件下还可以转分

3、化为胰岛素阳性细胞。MSC在心肌损伤的修复，骨代谢紊乱和多种代谢性疾病中中文摘要显示出很好的疗效。近年来发现间充质干细胞还具有逃脱免疫识别和抑制免疫反应的特性。通过阻断共刺激通路诱导耐受和延长胰岛移植物的存活亦受到广泛关注，抗CDl54单克隆抗体在诱导混合嵌合体中发挥着重要的作用。它能够有效的抑制活化的T细胞上CD40配基的表达并且阻止和抗原提呈细胞所表达受体的结合，阻止APC的上调MHC的作用，减少共刺激分子和细胞因子的表达。传统的骨髓细胞移植做为诱导混合嵌合体和胰岛移植耐受的手段的应用已多年，并且成为最稳定的成功措施。但是要获得满意的临床疗效又面临着许多困难，诸如预处理的毒性、移植物

4、抗宿主病和免疫低下等。由于MSC容易从骨髓里分离和扩增，并具有逃脱免疫识别和抑制免疫反应的特性，所以我们拟应用糖尿病小鼠模型进行同种异体胰岛移植，抗CDl54做为对受体预处理措施，并同时输注间充质干细胞和骨髓细胞，观察其对同种异体小鼠胰岛移植诱导混合嵌合状态，及对胰岛移植物存活时间的影响。目的观察MSC联合骨髓细胞输注对同种异体小鼠胰岛移植诱导混合嵌合状态，及对胰岛移植物存活时间的影响，为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径、提供新的依据。方法1、MSC分离培养、扩增分别取C57BL／6小鼠和KM小鼠颈椎脱臼处死，用L—DMEM培养基冲洗出股骨内的骨髓，首次24h换液后每3d换液，

5、依据贴壁培养法分离和扩增MSC，取第4代细胞作为移植供源，调整细胞数2X106／ml。2、供体骨髓细胞制备取出C57BL／6小鼠双侧股骨，用培养液冲出骨髓细胞，通过200目不锈钢筛网过滤，收集后加入红细胞裂解液去除红细胞，离心去上清，再洗涤两次用培养基重悬细胞调整8×107／ml备用。3、小鼠糖尿病模型的建立和胰岛移植STZ(180mg／kg)经腹腔一次性注射BALB／C小鼠，制备实验性糖尿病模型(连续2次血糖>16．7mmol／L)；造模成功后的小鼠经脊柱旁切口暴露左侧肾脏，注入肾包囊下约500IEQ胰岛。移植II硕士学位论文后l周每天监测随机血糖，以后隔日测1次血糖，连续两次血糖水平

6、大于11．1mmol／L，以第1次时间认为排斥反应发生。4、小鼠胰岛细胞的分离纯化摘取4只C57BL／6小鼠的胰腺，0．25mmPenfine针对胰腺反复多点注射胶原酶P后静止消化20min；采用自制的推进式离心管，以单一密度梯度Fieoll液(1．0889／m1)纯化胰腺消化物，双硫腙对胰岛进行特异性染色，利用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能；纯化后的胰岛移植到实验性糖尿病BALB／C小鼠的肾包囊下，术后观察其血糖变化。5、实验分组和处理近交系C57BL／6小鼠(H．2I

7、：供体MSC输注；C组：供体骨髓细胞输注；D组：供体骨髓细胞和MSC输注；E组：供体骨髓细胞和第三品系的KM小鼠MSC输注。每组各5只，均在胰岛移植术后经小鼠尾静脉输注上述细胞悬液。所有受体小鼠在胰岛移植的同时腹腔注射500pg抗CDl54单抗。6、供体细胞嵌合率检测移植后的第7、30、60d眼球采血100p1肝素抗凝后，加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心移去上清。按l嵋／106细胞加入FITC．H．2Kb单抗，充分混匀后置4℃冰箱避