基于高通量测序石刁柏基因转座子分析

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1、4摘要石／--j柏(AsparagusofficinalisL．)又名芦笋、龙须菜，属于百合科天门冬属多年生宿根性草本植物。石刁柏是典型的雌雄异株植物，不仅可以作为研究雌雄异株植物性别决定与分化的模式植物之一，也为植物性染色体起源与进化的研究提供了良好的实验材料。但是，目前对于石刁柏性染色体的起源和演化性别决定机制仍未获得直接的遗传学证据。转座子作为一种可移动的遗传因子广泛存在于植物基因组中，是造成染色体不稳定的重要因素之一，有可能是植物性染色体演化的启动器和推进器。因此，对于石刁柏基因组中转座子的全面分析有助于获得其性染色体起源及性

2、别决定的早期线索。基于此，本文以石刁柏为材料，在利用高通量测序技术获得的雌、雄基因组高通量序列的基础上，利用生物信息学技术对基因组中的转座子类型、分布及拷贝数等特征进行了分析。同时，对两个scaffolds序列进行了序列扩增克隆及鉴定，分析了序列结构特征及和同属近缘种间的序列变异分析，并对石刁柏的不同品种、不同单株、不同性别、不同单克隆及近缘种之间的异质性进行了比较分析。主要研究结果如下：1．基于高通量测序技术，共获得了17Gb的基因组序列，测序深度为12×，通过序列组装获得总计长约400Mbp的163406个scaffolds，占石

3、刁柏基因组的30％，其中转座子占石刁柏组装序列的53％，在总的转座子序列中LTR反转录转座子比例最大，占到总基因组的28％。在反转座子中，Tyl．copia类反转录转座子的拷贝数要明显高于Ty3-gypsy类反转录转座子。另外，通过对雌、雄基因组中转座子的比较结果表明，几乎所有的转座子类型在雌、雄基因组中都是高度相似的，包括反转录转座子类型中的Ty3-gypsy、LINE和SINE，以及DNA转座子类型中的Ac／Ds、MULE、Mariner和ping／pong／SNOOPY，它们各占雌、雄基因组的百分比差异范围为0～0．261％；仅

4、有个别的转座子类型中存在有微小的差别，包括反转录转座子类型中的Tyl一copia和DNA转座子类型中的CACTA，两者分别在雌、雄基因组中的比例差异为1．99％和0．50％。这一结果与石刁柏性染色体起源较晚是一致的。2．通过NCBI中Blastp对获得的石刁柏的109条序列进行序列特征搜索发现，109条序列均为Tyl一copia类反转录转座子，其中，scaffoldl01366的52条序列中有25条序列为Tyl一copia逆转录酶保守区，有11条序列为RNA酶保守区，有17条序列既为Tvl一copia逆转录酶保守区，又为RNA酶保守区

5、；scaffoldl07518的57条序列中有36条序列为Tyl．copia逆转录酶保守区，有6条序列为RNA酶保守区，有15条序列既为TVl．copia逆转录酶保守区，又为RNA酶保守区。因此，进一步证明所获得的两个scaffold序列是反转录转座子序列。3．根据测序结果对序列scaffold101366和scaffold107518的PCR扩增结果表明，在所扩增的109条序列中序列和测序结果一致性均达到95％以上。获得的scaffold101366的序列共55条，经多序列比对结果显示，石刁柏的52条序列一致性为92．44％。对突变

6、位点的分析发现共有326处位点发生了突变，其中发生了2082次碱基转换，占碱基置换的80％，其中，T—C占51．28％，G—A占48．72％；508次碱基颠换(T—A，AHC，T—G，C—G1。而获得的scaffold107518的序列共有59条，多序列比对结果表明，石刁柏的57条序列的一致性为92．13％。突变位点分析结果表明，有227处突变位点，碱基转换发生了3039次，占碱基置换的80％，其中，THC占50．89％，GHA占49．11％；碱基颠换发生了760次。由以上结果说明，在所分析的两个石刁柏ryl—cop／a反转录转座子其

7、异质性的产生主要是由于碱基转换造成的。4．利用MEGA软件对scaffold101366的55条序列构建的进化树表明，两个石刁柏品种(TD818和UC309)中的Tyl一copia序列可以聚为两个大组GroupI和GroupII，但是，通过对两组序列的分析发现序列聚类未表现出性别和品种的特异性；而且，和其近缘种文竹的序列相比种内异质性大于种间异质性。scaffold107518的59条序列构建的进化树结果也表明，该转座子在石刁柏品种间、性别间均未表现出特异性且石刁柏的两个品种中的Tyl一copia序列均与文竹中的Tyl一coph2序列

8、无明显差异。由此说明，Tyl一copia反转录转座子在石刁柏的不同品种、不同性别、不同单克隆及近缘种中均具有极高的保守性，也说明了反转录转座子不仅可以在世代间进行纵向传递，也可以在物种间进行横向传递，同时，也进一步证实了