人脐血间充质干细胞定向分化为神经细胞与基因修饰的实验研究论文

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1、中南大学博上学位论文摘要人脐血问充质干细胞定向分化为神经细胞及基因修饰的实验研究博士研究生罗芳指导老师杨于嘉教授副指导老师黄榕教授摘要新生儿缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是新生儿期脑损伤最为常见的疾病，是引起新生儿死亡、影响新生儿正常发育、导致儿童脑瘫、精神发育迟滞、学习障碍和癫痫等神经系统伤残的主要原因。本病发病率较高，推测国内每年约有750000新生儿发生窒息．约有25万婴儿因而成为伤残儿和，或低智儿童(韩玉昆，1995)。尽管围产医学和对HI

2、BD发病机制研究均取得很大发展，临床上仍以对症支持综合治疗为主而缺少特异性的有效手段。因此为新生儿缺氧缺血脑损伤寻找新的治疗途径十分必要。细胞移植和基因治疗已成为治疗中枢神经系统损伤和退行性变的最有潜力的手段之一。然而这两种治疗方法目前仍存在许多有待解决的问题。传统的细胞移植物来源于人的胎脑、胚胎神经组织和神经干细胞，这些移植物虽然可以定向分化为各类神经细胞而发挥替代作用，但因取材困难、涉及伦理学争议及免疫排斥等问题限制了应用的空间(Bjorklund，2000)。基因治疗的一些载体如腺病毒、逆转录

3、病毒、杆状病毒也同样存在使用的安全性、免疫排斥等问题(Somia，2001)。因此，选用何种细胞做为移植来源和基因载体是能否用于临床的关键所在。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，起源于中胚层，主要位于成体骨髓。在脐血和外周血中也有少量的MSCs存在(Eriee，2000；Goodwin，2004；Jeong，2004；Femandez，t997)。MSCs具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为各种组织细胞，如成

4、骨细胞、成软骨细胞、成肌腱、成肌细胞、脂肪细胞和神经细胞中南大学博上学位论文摘要(Owen，1998；Young，1998；Wakitani，1995；Dennis，1996；Azizi，1998；Kopen，1999；Sanchez—Rmnos，2000；Brazelton，2000；Woodbury,2000)。已有实验证实，MSCs体内移植可以有效改善脑缺血、创伤性脑损伤或帕金森病脑损伤等大鼠模型的神经功能(Chen，2000；Chert，2001；LiY,2001；MahmoodA，2001

5、；许予明，2004)。MSCs用于移植具有以下的优点：①具有贴壁生长的特性易于在体外分离和扩增；具有强大的增殖能力，足以满足移植的需要；在适宜的条件下MSCs可在体外传25代。1ml骨髓吸取物经传代后可产生几十亿个MSC(Colter，2000)。②可在体内外表达多种治疗性的外源目的基因(Chen，2000：HoCY，2005)，被认为是一种理想的基因治疗中的靶细胞。③可以进行自体移植，避免了免疫排斥问题。④除局部定位移植外，还可进行系统移植如经静脉输注(Li，2001；Yukinori，2002；

6、Chen2001)，此移植方式便于今后应用于临床。然而，取材于骨髓的MSCs同时也存在着应用上的局限性：首先，骨髓MSCs的取材对供者仍可造成一定的损伤；其次，个体骨髓容易受到病原的侵袭尤其是疱疹病毒的感染；再次，随年龄增长骨髓细胞数量及其增殖和分化潜能下降(D’Ippolito，1999；Rao，2001)等。因此，寻找新的MSCs来源很有必要。与人骨髓和外周血相比，源于脐血的间充质干细胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，UCB．MSCs)所具备的来源

7、丰富、易获性、无刨性、较少受病原体侵袭、可用于冻存等优点，使其在近年来逐渐受到研究者的重视。而且，脐血免疫原性相对较弱，其内淋巴细胞相对不成熟(TaylorS，1985；LuL，1996)，还能用于HLA(humanleucocytesantigen，人类自细胞抗原)配型不符者之间输注(Maitra，2004)。如果源于脐血的MSCs能在体外培养并建系，有望成为临床上治疗中枢神经系统损伤和退行性病变的可行性方法。尤其针对于新生儿HIBD，由于骨髓采集存在一定困难，自体脐血取材的便利性、无创性、实用性

8、等优势显而易见。然而迄今为止，对UCB-MSCs的研究目前仍处于初级探索阶段，远不如骨髓MSCs被广泛研究应用，其主要面临的问题如下：①UCB．MSCs体外培养困难，从脐血中收获MSCs的成功率远低于骨髓，文献报道均未超过30％(Erices，2000；周敦华，2003；Bieback，2004)，足月儿产率更低为12．5％(Bieback，2004)，而骨髓MSCs一般在60％以上。所以体外培养所碰到的数中南人学博士学位论文摘要量少、成功率低是UCB—MSCs用于研