牛卵泡抑素基因和ω3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因转基因载体的构建与其检测

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1、载体的构建及其检测摘要以转基因细胞作为供体细胞，利用核移植技术生产转基因动物是目前转基因家畜的主要技术手段。针对与牛生长发育和肉质改善相关的基因，我们构建了牛卵泡抑素基因真核表达载体、牛卵泡抑素基因与gO．3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因真核共表达载体，并转染到和牛胎儿成纤维细胞中。在对转基因细胞进行检测后，通过体细胞核移植技术制备转基因胚胎。利用Trizol提取转基因胚胎的总RNA，并通过RT-PCR(反转录PCR)的方法扩增外源基因，验证基因在胚胎中的表达。1．牛卵泡抑素基因真核表达载体构建用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA，反转录成cDNA，

2、用带有酶切位点的牛卵泡抑素基因(Follistatin，FST)的特异性引物扩增其完整编码区序列，连接到T载体、测序，序列无误后亚克隆入真核表达载体plRES2．AcGFPl中，经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体plRES2．AcGFP1．FST。2．牛卵泡抑素基因与t．O．3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因真核共表达载体构建用带有酶切位点的特异性引物扩增本实验室已有的人缘化的线虫∞．3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因fat．1完整编码区序列，连接到T康峰牛卵泡抑素基因和D?3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因转基因载体的构建及其检测载体、测序，序列无误后亚克

3、隆入真核表达载体plRES2．AcGFPl．FST中，替换AcGFP基因，经酶切及PCR鉴定表明成功构建了真核表达载体pFST-IRES2．FAT1。3．和牛胎儿成纤维细胞的体外培养及基因转染使用组织块贴壁法得到和牛胎儿成纤维细胞，使用LipofectamineLTX将表达载体plRES2一AcGFPl一FST和pFSToIRES2一FATl分别转入和牛胎儿成纤维细胞基因组中。使用G418药物筛选转基因细胞，plRES2．AcGFPl．FST转染的细胞利用绿色荧光蛋白进一步得到细胞克隆，而pFST-IRES2．FATl转染的细胞利用PCR的方法鉴定转

4、基因细胞克隆。4．转基因胚胎的制备与基因表达鉴定常规技术将转plRES2一AcGFPl-FST和pFST-IRES2-FATl的转基因供体细胞融入去核卵母细胞中。经体外培养获得克隆囊胚。用Trizol提取转基因胚胎总RNA，并通过RT-PCR(反转录PCR)的方法扩增外源基因‘，验证了基因在胚胎中的表达。关键词：牛卵泡抑素基因；CO．3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因；真核表达载体构建：体细胞核移植Inthepresentstudy,theeukaryoticexpressionvectorsofplRES2一AcGFPl一FSTandpFST-IRES2

5、一FATlwereconstructed．Thevectorswerethentransfectedintowagyufetalfibroblastcellsrespectivelyandthepositivecellswereusedasdonorstocreateclonedembryos．TheclonedblastocystswerethenidentifiedbyRT-PCRusingtotalRNAastemplatefortheexpressionofbovinefollistatineDNAandfat-1．Thefollowings

6、arethemajorresults．1．ConstructionofeukaryoticexpressionvectorplRES2··AcGFPl·-FSTTotalRNAwasextractedfrombovineovarybyTrizoltotalRNAExtractKit，andthewholecodingregionofbovinefollistatineDNAgeneWasclonedbyusingspecificprimerswhichhaverestrictiongnzymecuttingsite．Thepurifiedbovine

7、follistatineDNAwasinsertedintopMD18-Tvectorandsequenced．SubclonethecorrectfollistatineDNAto3specificprimerswhichhaverestrictionenzymecuttingsite．Thepurifiedfat-1eDNAwasinsertedintopMD18一Tvectorandsequenced．Subclonethecorrectfat-1cDNAtoeukaryoticexpressionvectorpIRES2-AcGFP1一FST

8、,replacingtheAcGFPgenebyfat-1cDNA．Double—enzymecleavag