超长链多不饱和脂肪酸合成关键酶基因的密码子优化及油脂合成相关基因的克隆

《超长链多不饱和脂肪酸合成关键酶基因的密码子优化及油脂合成相关基因的克隆》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东农业大学硕士学位论文中文摘要超长链多不饱和脂肪酸(verylongchainpolyunsaturatedfattyacids，VLCPUFAs)，通常指含有18个碳原子以上并且带有2个或2个以上的顺式不饱和双键的脂肪酸，比如花生四烯酸(AA，20：4A5,8,11,14)、二十碳五烯酸(EPA，20：5A5,8,11,14,17)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6A4,7,10,13,16,19)。其中，EPA和DHA是鱼油的主要有效成分，对人体营养和健康具有重要的意义。目前，该类脂肪酸的主要来源是深海鱼油。但是随着环境污染的日益加剧以及过度捕捞造成的野生

2、海洋鱼类资源的急剧减少，鱼油的产量和质量都已经不能够满足人们的要求。因此，寻找一条安全、稳定、可持续的EPA／DHA替代生产途径已经成为当务之急。众多研究表明，利用基因工程的方法，在高等植物(特别是油料作物)中重组EPA／DHA的合成途径进行鱼油的替代生产是可行的，并且取得了一定的进展，但是EPA尤其是DHA的产量仍然不高，经过分析推测，造成EP加HA产量不高的原因可能是目标植物的选择、特异性启动子的选择、酶基因的活性高低、代谢途径的选择、异源表达时密码子的偏好性以及转录因子的调控等。本研究从异源表达时密码子的偏好性方面展开研究，对EPA／DHA合成途径中的关键

3、酶基因进行多种方式的密码子优化，通过对优化后酶基因的表达活性进行分析，探索出一条密码子优化提高基因表达活性的最佳方案。为在植物中高效生产EPA／DHA奠定基础。同时，我们从高产EPA／DHA的强壮前沟藻(Amphidiniumcarterae)中对油脂合成的关键酶甘油．3．磷酸脱氢酶(GPDH)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因进行了克隆，为改良油料作物的油脂产量提供基因资源。主要结果如下：(1)球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中△9链延长酶基因的密码子优化A9链延长酶是“A8去饱和途径”中的关键酶，对于整个合成途径具有重要意义，根据本实验室

4、已有的研究，结合对来源于球等鞭金藻的△9链延长酶基因在拟南芥中表达时密码子使用情况的分析，我们采取了两种策略对△9链延长酶基因进行密码子优化：第一种策略是针对偏好性最强的密码子进行优化，对△9链延长酶基因中的3个编码精氨酸的CGC密码子(使用频率只有20％)以不同的方式进行优化(单个CGC密码子的优化、多个CGC密码子的优化以及3个CGC密码子的全部优化)，优化成在拟南芥中高效表达的AGA密码子，编码氨基酸不变；第二种策略是根据N端稀有密码子的存在会导致基因表达降低的研究结果，将△9链延长酶基因的N端16个密码子全部优化成超长链多不饱和脂肪酸合成关键酶基因的密码

5、子优化及油脂合成相关基因的克隆在拟南芥中高效表达的密码子，编码氨基酸不变。转拟南芥进行基因表达活性分析，以未优化的△9链延长酶基因作为对照，与对照相比，单个CGC密码子优化与多个CGC密码子优化的A9链延长酶的表达活性变化不大，而3个CGC密码子全优化与N端16个密码子全优化的△9链延长酶活性提高较明显，且N端16个密码子全优化方案略优于3个CGC全优化方案。(2)马铃薯致病疫霉(Phytophthorainfestans)中△6去饱和酶基因的密码子优化为了验证△9链延长酶优化结果的普遍性，我们又对△6去饱和酶进行优化，并且在酿酒酵母中进行鉴定。△6去饱和酶是“

6、△6去饱和途径"中的关键酶，本实验室已经从马铃薯致病疫霉中成功克隆到了VLCPUFAs合成途径中的多个酶基因并在酿酒酵母中进行了功能鉴定，其中△6去饱和酶的活性很低，还不到10％。通过比较△6去饱和酶基因在马铃薯致病疫霉与酿酒酵母中表达时密码子的使用频率，并在对优化的A9链延长酶的研究基础上，我们采取了两种策略优化△6去饱和酶基因：第一种策略是针对偏好性最强的密码子进行优化，将△6去饱和酶基因的4个CGC密码子(使用频率仅13％)全部优化成酿酒酵母中高效表达的AGA密码子，编码氨基酸不变；第二种策略是将N端16个密码子全部优化成酿酒酵母中高效表达的密码子，编码氨

7、基酸不变。转酿酒酵母进行表达活性分析，以未优化的△6去饱和酶基因作对照，与对照相比，4个CGC密码子全部优化和N端16个密码子全部优化的A6去饱和酶的活性都大大提高，无论是∞3转化率还是∞6转化率，都提高了30％之多，而且N端16个密码子全优化略优于4个CGC密码子全优化的方案。这与△9链延长酶优化结果一致。(3)强壮前沟藻(Amphidiniumcarterae)中油脂合成关键酶基因的克隆我们对富含DHA的强壮前沟藻的转录组进行了测序，经过生物信息学分析得到了许多油脂合成关键酶基因的部分序列。以强壮前沟藻的cDNA为模板，分别进行YRACE和5'RACE扩增，

8、获得了甘油．3．磷酸脱氢