香蕉mads-box基因的克隆、表达及与乙烯生物合成和信号转导的关系研究

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1、海南大学2008届硕士研究生毕业论文摘要香蕉是世界上最重要的水果之一，被联合国粮农组织定为世界第四大粮食作物。香蕉果实的采后成熟过程关系着香蕉的品质和货桨鹈的长短，香蕉品质和货架期又直接影响到香蕉产业的发展。因此研究香蕉采后成熟过程及调控对于香蕉品质形成和发展改良创新采后保鲜和催熟技术具有重要意义．通过对乙烯生物合成速率的测定发现，香蕉采后的不同时期内，乙烯的生物合成速率会发生一系列的变化。根据文献报道，从香蕉果实中克隆了香蕉采后果实成熟过程中乙烯生物合成的两个关键酶基因：Ma-AC01(登陆号A陀23232)和Ma-ACSl(登陆号AB0219

2、06)。选取正常成熟和乙烯诱导成熟两种处理条件下处于不同成熟阶段的香蕉果实，提取总RNA，采用荧光定量PCR的方法对Ma．AC01和Ma．ACSl的表达量的变化进行了研究，结合成熟乙烯生物合成的结果表明：Ma-ACSl直到系统2乙烯大量产生时表达量才显著升高，是启动乙烯生物合成的关键酶，而Ma-ACOl在系统1基础水平的乙烯生物合成中起作用并于乙烯峰时表达量迅速提高。乙烯作为植物激素发挥其调控生长发育的作用要通过乙烯信号转导过程，其第一步就是乙烯与乙烯受体的结合。本研究首次利用荧光定量PCR方法，对香蕉中乙烯受体基因Ma．ETR(登陆号Afll3

3、748)在正常成熟和乙烯诱导成熟果实中的表达量的变化进行研究，结果表明，Ma-ETR基因表达变化可能受乙烯生物合成速率调节，而且推测其也受外源乙烯的诱导。为在分子水平上深入了解香蕉果实采后成熟的机理，分离香蕉果实采后差异表达基因就成为一种有效的手段。我们通过抑制缩减杂交和cⅨ、IA微阵列相结合的方法分离获得了在香蕉成熟早期上调的一个煳S．box基因的cDNA片段。在此基础上从香蕉果实cDl姚文库中，采用RT-PCR技术分离获得一个全长cDNA，经序列测定和同源性分析表明，该cDNA含705bp的完整的开放阅读框，编码234个氨基酸残基的MADS-

4、box蛋白，由于其是第二个从香蕉中克隆到的MADS．boX基因，因此将其命名为蚰lMADS2(№㈣S-box2)。MuMADS2全长1169bp，具有植物MADS_box基因家族中特有的M、I、K和C四个结构域，与芦笋、风信孑、蝴蝶兰和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性(82％，78％，77％和75％)。将香蕉MADS．box基因的克隆、表达及与乙烯生物合成和信号转导的关系研究M心几∞S2与其它植物来源的MADS-box基因进行序列比较发现，MuMADS2属于植物MADS-box基因的AGAMoUS亚族的D世系。采用R1’．P

5、CR的方法对其在香蕉各器官的表达情况进行分析表明，M心似DS2仅在生殖器官(花和果)中表达，在营养器官(根、茎和叶)中不表达。而且在生殖器官中也具有组织特异性，即M心俏DS2仅在雄花和雌花的子房、由雌花发育而成的果实中表达，而在雄花和雌花的柱头和花柱都不表达。据此推测M心仫DS2可能在果实的生长和发育过程中起作用。同样采用荧光定量PCR的方法研究M、lMADS2在正常成熟和乙烯诱导成熟的香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明，在正常成熟的果实中，MuMADS2的表达量在采后6d就达到了峰值，比成熟乙烯生物合成启动的时间提前了4天。随后下降，

6、到采后14d，乙烯生物合成达到最高值时，MuMADS2又有小幅的上升，随，之又急剧下降。这说明很可能是M心似DS2表达量的升高诱导了成熟乙烯的生物合成。在乙烯诱导成熟的果实中，MuMADS2的表达量的升高发生在采后2d的果实中，而此时成熟乙烯的生物合成开始启动。随后迅速下降，而当成熟乙烯达到最大值时(8d)，Ml】MADS2的表达量也达到了最大值。这说明，在乙烯诱导成熟的果实中，MuMADS2表达量的变化可能受到乙烯的诱导而呈现出与正常成熟果实中所不同的表达方式，但M心似DS2表达的峰值在两种处理条件下相差不大。转基因技术是目前进行基因功能验证的

7、有效手段，以pCAMB认1302载体为基础，将M心乱如S2成功插入到35s启动子下游，GFP基因上游，构建好的植物表达载体命名为pCAMBIAl302．M心乱如S2，为后续的转基因验证功能工作奠定了基础。为研究M心必DS2的原位表达，制备了M孙AC01、Ma-ACSl、Ma-ETR、M心似DS2的I矾A探针，并做了香蕉果实败育胚珠的石蜡切片，为原位杂交实验的展开做好了准备。关键词香蕉(^缸s口ac眦inataL．础kAgroupcv．Br瘟1iaJl)；MADS-box基因；MllMADS2；荧光定量RT．PCR；乙烯Ⅱ海南大学2008届硕士研究

8、生毕业论文Abs仃actBallamisoneoft11emostirllportant丘1litintl：le、vorl(【，andi