负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用

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1、第三军医大学硕士学位论文负载脊髓匀浆蛋白的树突状细胞促进小鼠脊髓损伤功能恢复的作用摘要脊髓损伤(spinalcordinjury，sCI)通常导致灾难性的神经功能缺损，传统治疗方法作用有限。随着对ScI免疫反应研究的深入，保护性．自身免疫反应在SCI神经功能恢复中的作用引起关注。树突状细胞(dendriticcells，DCs)是专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcells，APC)，在幼稚T细胞的活化、免疫方向的调控甚至T细胞极性的转换等方面具有重要作用。已经证实，损伤局部注射负载髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)或其衍生肽的DCs可以促进

2、SCI后神经功能恢复。但MBP成分单一，制各较困难，不利于临床推广且作用有限；局部注射需要显露椎管，操作复杂，损伤大。脊髓匀浆蛋白(homogenateproteinofspinalcord，hp)理论上包含SCI局部所有的可能抗原成分，更为接近体内真实环境，且制备简单，便于临床使用；腹腔注射操作简单，损伤小。本文旨在探讨负载脊髓匀浆蛋白的DCs(dendriticcellspulsedwithhomogenateproteinofspinalcord，hpDCs)能否促进SCI神经功能恢复以及腹腔注射的效果和局部注射是否有差别。材料与方法1．制作小鼠SCI模型。成年BALB尼小鼠，使

3、用显微外科动脉夹制作TlO节段重度钳夹伤SCI模型。2．制备小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs。3．实验干预及分组。实验动物分3组，伤后1天，BBB评分<2分者，分别局部或腹腔注射hp(局部：40pg／5止；腹腔：40pg／o．3札)、DCs(局部：1×106cells／5此；腹腔：1×106cells／0．3rIlL)或hpDCs(局部：1×106cells／5“L；腹腔：1×106cells／O．3mL)。4．各动物每周进行BBB评分，观察神经功能恢复情况。5．注射后28、56、84天(dayspostinjection，dpi)，左心室灌注固定后取材，HE染色观察局部病变情况，测

4、量脊髓损伤区长度。6．免疫组织化学染色(IHc)与免疫荧光组织化学双标法观察损伤后GFAP、Nestin、NF在损伤区表达情况，测量胶质瘢痕厚度。7．脊髓损伤大鼠在84dpi行生物素化葡聚糖胺(biotjnylateddextranamine，BDA)6第三军医大学硕士学位论文轴突顺行示踪，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)轴突逆行示踪，结合IHC检测胶质瘢痕与轴突、囊腔的关系。结果1．各组小鼠在伤后均出现完全性截瘫，1w左右BBB评分逐渐恢复。其中，hpDCs组小鼠恢复最快，于28dpi进入平台期，BBB评分高达14．O±2．O，最终达到16．3±2

5、．1，显著高于DCs组(10．0±2．0)和hp组(10．4±1．8)p<0．01)。腹腔注射和局部注射BBB评分结果无统计学差异。2．HE染色显示各组损伤局部均出现反应性胶质瘢痕增生，空洞形成。但是，hpDCs组损伤局部空洞范围与DCs、hp组比较具有显著统计学差异p

6、而其它二组在注射后28dpi基本消失；NF表达可以明确地观察到损伤后轴突分布的情况，各组无显著区别。4．各组中，BDA顺行示踪与HRP逆行示踪观察到轴突终止于胶质瘢痕外，未到达囊腔内。结论1．本实验制备的小鼠脊髓钳夹伤模型，造成脊髓严重不完全损伤，其病理过程和临床接近，能够模拟临床自然病程，符合实验要求。2．局部或腹腔注射hpDCs，能够显著促进小鼠SCI神经功能恢复，而hp具有相对较弱的促进作用，单纯DCs效果最差。3．腹腔注射和局部注射具有同样效果，表明hpDCs是通过全身性的系统免疫起作用。4．hpDCs可以延缓局部胶质瘢痕形成，降低胶质瘢痕密度和厚度，缩小局部空洞及损伤部位面积

7、，提示可以降低胶质瘢痕对神经再生的屏障作用；可以延长局部Nestin表达，提示可以增加局部存在的内源性再生能力。5．免疫组织化学荧光双标技术及神经纤维示踪技术证实hpDCs不能够使轴突穿过胶质瘢痕。6．hpDCs较单纯DCs或hp效果好，表明局部DCs效应不足，或者与抗原结合能力受限。7第三军医大学硕士学位论文综上所述，本文通过小鼠脊髓钳夹伤的神经功能评价、病理学及免疫学研究，发现负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞可以促进ScI后神经功能恢复，