生物素亲和素酶联免疫分析测定人血小板膜糖蛋白功能的方法建立与临床应用

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1、—1J学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年月解密后适用本规定。非涉密论文圈论文作者签名：弛遮FJ期：导师签名：《蒡蓬红日期：C一，加／D，oJ'--o乡中文

2、摘要、板膜糖蛋白研究背景：血栓形成是心脑血管疾病发生和发展的重要病理机制，而血小板在血栓形成过程中起着关键作用。血小板通过血小板膜糖蛋白实现粘附、聚集和活化反应等功能。已知血小板P．选择素(CD62p)和糖蛋白lib／Ilia(GPIIb／IIIa)在血小板膜上的表达量的增加可以作为血小板活化的特异性指标。在一些血栓性疾病中，如心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病中，血小板常呈现活化状态。测定血小板膜糖蛋白表达水平可以了解血小板的活化状态。目前，常用电泳法、放免法和流式细胞术等检测血小板膜糖蛋白，但均有不足之处。本研究采用抗血小板膜糖蛋白的单克隆抗体包板，以生物素．亲和素．酶联免疫反应(BA-ELI

3、SA)测定血小板膜糖蛋白功能。该方法的建立将填补国内BA．ELISA方法检测血小板膜糖蛋白功能的空白，易于在临床推广应用，将具有较大的经济和社会效益。目的：(1)应用单克隆抗体和生物素．亲和素系统建立生物素．亲和素．酶联免疫分析方法，并对其灵敏度、批内和批间差异等方法学考核。(2)该方法应用于临床标本(急性心肌梗死、急性脑梗死和糖尿病患者等)检测并评价临床实用价值。方法：应用抗血小板CD62p单抗SZ51和抗血小板GPIIb／IIIa单抗7E3分别包板，加入经ADP诱导的或未诱导的正常人富含血小板血浆(PRP)，以生物素标记的抗GPIb单抗SZ2(Biotin．SZ2)反应后，加入亲和素标记的

4、辣根过氧化物酶(Avdin．HI冲)检测，邻苯二胺(OPD)显色后，酶标仪读取吸光度值(OD)。对其灵敏度，批内、批间差异作方法学评估，并应用该方法对抑制性单抗SZ21和阿司匹林抑制血小板活化中文摘要生物素-亲和素．酶联免疫分析测定人血小板膜糖蛋白功能的方法建立及临床应用的功能效果测定，并与流式细胞术(FCM)进行比较。应用该方法分析急性心肌梗死患者(AMI)、急性脑梗死(acutecerebralinfarction，ACI)患者、糖尿病(diabetesmellitus，DM)患者及正常人的血小板膜上的CD62p和GPIIb／IIIa的水平，并与流式细胞术(FCM)作比较。结果：(1)灵敏

5、度：该方法可检测血小板计数低达6．25x109／L(sz51包被板)和3．13x109／L(7E3包被板)的标本。(2)重复性：该方法测定血小板膜的CD62pOD值的批内差异和批间差异分别为4．38％和6．23％(n=10)；GPIIb／IIIa的OD值的批内差异和批间差异分别为5．78％和6．96％(n=10)。(3)方法学比较：本法和流式细胞仪同时测定正常人和患者的CD62p和GPIIb／IIIa水平。结果经直线回归分析得r=0．86，可见两方法有较好的相关性。(4)血小板聚集抑制实验：设SZ21抑制组、阿司匹林抑制组和对照组。BA．ELISA实验结果显示，在体外ADP诱导的血小板聚集实验

6、中，SZ21和阿司匹林可明显抑制血小板的活化，且其抑制作用呈剂量依赖性。(5)临床应用：应用本法测定30例AMI、30例ACI、30例DM患者和50例正常人的ADP诱导的(未诱导的)血小板的CD62p和GPIIb／IIIa的OD值。其分别为1．76±0．56(O．72_+0．25)，1．95±0．53(1．53±0．61)；1．51_+0．14(0．61±0．16)，1．88±0．42(1．46±0．57)和1．38_+0．26(0．43±0．21)，1．61±0．42(1．23±0．32)，显著高于正常人0．68±0．21(O．18±0．09)和0．87±0．29(0．44±0．14)(P<

7、0．01)。同时与FCM方法检测血小板膜表面CD62p和GPIIb／IIIa表达情况作比较，结果一致。结论：(1)首先在国内建立了人血小板膜糖蛋白功能测定的BA．ELISA检测方法。(2)该方法敏感性好、特异性高、重复性好。(3)该方法可以测定血小板功能活化剂或抑制剂对血小板功能影响，有助于抗血小板药物筛选、临床用药指导和药物监测；可以测定血栓性疾病或血栓形成相关性疾病引起的血小板活化程度，有助于