人蛔虫提取物抗肿瘤作用与其机制的实验研究论文

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1、摘要目的：通过体内外试验，探讨人蛔虫提取物(bodyextractofAscarislumbricoides，BEAL)对小鼠LLC细胞株的细胞毒作用，建立小鼠LLC荷瘤模型，探讨人蛔虫提取物对肿瘤的作用及其免疫学机制。方法：1．人蛔虫提取物的制备：对蛔虫感染者一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg／Kg体重)，服药后从粪便中收集蛔虫成虫。取完整的蛔虫洗净后用含100U／InJ青霉素、链霉素的无菌生理盐水浸泡15分钟，滤纸吸干，在超净台内解剖蛔虫，取出内脏丢弃，收集虫体，，时匀浆器搅碎后，在10，000×g离

2、一L,30分钟，取上清，经0．451Jm醋酸纤维膜过滤除菌，用核酸蛋白分析仪测蛋白含量为32001且g／ml，置-30℃储藏备用。2．肿瘤细胞的筛选：小鼠Lewis,日*癌细胞株(LLC)、小鼠肝癌细胞株(Hepa1-6)和小鼠淋巴瘤细胞株(EL4)均购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。用四氮唑盐酶还原法(microculturetetrazoliumtest,MTr)检测人蛔虫提取物对三种肿瘤细胞的细胞毒作用，以筛选出最敏感细胞株和最佳作用浓度。3．绘制LLC细胞生长曲线：取对数生长期的LLC细胞常规

3、消化，用RPMI．1640+10％FCS培养液调整细胞密度为1×105／叫，将细胞分别接种于24孔培养板中，lml／孑1．,，置37℃、5％C02的细胞培养箱中培养。每天取三孔细胞进行消化后计数，取平均值，连续观察7d。其余细胞隔2d换液，根据所得数据绘制细胞生长曲线。4．LLC细胞毒性实验：取对数生长期的LLC细胞消化后，用RPMll640+1096FCS的培养液调整细胞密度为L×105／lIll，加入96：j：L板，lOOp．1／孑L，置37℃、5％C02的细胞培养箱中培养24h，弃去孔内液体，加入

4、不同浓度的BEAL(起始浓度为32001Jg／ml的BEAL倍比稀释至12．5I．tg／rnl)，每个浓度3个复孔，Ⅱ摘要置37℃、5％C02的细胞培养箱中分别培养24h、48h、72h。弃去孔内液体，加入MTT，置37℃、5％C02的细胞培养箱中。4h后取出，加入二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，置酶标仪检测OD492，取细胞存活率>／50％的BEAL浓度为诱导实验的起始浓度。5．荷瘤小鼠模型的建立：将LLC细胞株扩增后对小鼠进行肿瘤造模：以细胞密度为1X107／wa，0．1

5、ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下。6．实验分组：A组一人蛔虫提取物事先干预组(BEAL+LLC)：腹腔注射浓度为10099／rrd的BEAL，0．1ml／只，隔天一次，10d后肿瘤造模；B组一生理盐水事先干预组(NS+LLC)：腹腔注射生理盐水，0．1ml／只，隔天一次，10d后肿瘤造模；C组一肿瘤造模后提取物干预组(LLC+BEAL)：以细胞密度为1×107／ml的LLC细胞悬液，0．1ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用BEAL干预，隔天一次；D组一肿瘤造模后生理盐水干预组(LLC+NS)

6、：以细胞密度为lX107／rra的LLC细胞悬液，0．1ml／只，接种于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用生理盐水干预，隔天一次；E组一阴性对照组，正常饲养，不加任何处理。10d后处理各组小鼠进行实验。‘7．巨噬细胞的分离和培养：常规无菌状态(详细见下文)制备小鼠巨噬细胞，加入含有100U／ml青霉素、链霉素、10％FCS的RPMll640培养液，调整细胞密度为1×106／IIll，收集于24孔培养板中，置37℃、5％C02培养箱中培养。8．脾淋巴细胞的分离和培养：常规无菌状态制备小鼠脾细胞，加入含有100U

7、／ml青霉素、链霉素、10％FCS的RPMll640培养液，调整细胞密度为l×106／lnl，收集于6孔培养板中，置37℃、5％C02培养箱中培养。9．细胞因子的表达：巨噬细胞和脾淋巴细胞培养72h后收集上清，用ELISA法检测各实验组培养上清中TNF．Q、IFN吖、IL-4、IL．10的表达。10．LLC细胞有丝分裂指数：普通光学显微镜下观察有丝分裂相细胞，取细胞数多、中、少3个区域各一区，共计数1000个细胞，计算出细胞有丝分裂指数(mitoticindex,MI)。11．胸腺和脾脏指数：人蛔虫提取

8、物干预荷瘤小鼠，10d后取出小鼠胸腺、脾脏称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，得到胸腺指数和脾脏指数：12．统计学分析：用SPSSl3．0处理各组实验数据，对上述实验结果进行统计学分析。实验结果以均数±标准差(x+S)表示。细胞毒实验数据转化为细胞杀伤率后采用方差分析(F检验)，HE染色计算细胞分裂指数所得数据做平方III摘要根反正弦转换，然后进行方差分析。ELISA数据直接进行方差分析，样本均数的两两比较用q检验。P<0．05表示有显著