反式hdv核酶重组载体的筛选与特异性研究

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1、研究生导师和课题指导老师介绍导师简介：韩金祥，男，1963年10月出生，研究员，博士，博士生导师。主要从事微生物与生化药学、医学分子生物学的研究工作。指导老师简介：鲁艳芹，女，1971年10月生，副研究员。主要从事病毒分子生物学的研究工作。学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学院。山东省医学科学院

2、享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。论文作者签名：基i垒导师签名：山东省医学科学院四2006届硕士研究生学位论文反式HDV核酶重组载体的筛选及特异性研究硕士研究生：栾中华导师：韩金祥研究员鲁艳芹副研究员摘要研究背景我国是肝炎大国，全国约有1．2亿HBsAg的携带者。乙型肝炎病毒感染，不仅能引起急、慢性肝炎，还与肝硬化和原发性肝癌的发生、发展关系密切。目前乙肝临床药物主要是核苷类衍生物以及干扰素等，核苷类衍生物包括拉米夫定，泛昔洛韦等．虽然它们在一定程度上能预防

3、乙肝病毒的复制，但目前尚没有能根除HBV感染的特异有效的治疗方法。核酶(rih,zym0是一类具有生物催化活性的RNA分子，可特异性结合并切割靶RNA，从而达到有效阻断基因表达的目的。目前发现的核酶有七种，包括锤头状核酶、发卡状核酶、HDV核酶、VS核酶、RNaseP和I类及Ⅱ类内含予核酶。HDV是目前发现的唯一一种在人类细胞内具有天然核酶活性的病毒，是由1．Tkb组成的缺陷型负链RNA病毒，呈环状。其在细胞内的复制是通过滚环机制，由宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ参与的RNA指导的RNA复制，产生线状基因组和反基因组，由核酶将长的转录物剪切成单位长度的RIgA．作为HBV的微卫星病毒，病

4、毒核心需要乙肝病毒(HBV)的HBsAg进行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒颗粒。所以HDV总是伴随HBV感染，否则HDV的感染就是一个自限性的过程而不能形成慢性感染。因此HDV核酶应该更适应人类细胞内的环境，而具有较高的核酶活性。HDV核酶较锤头状和发夹状核酶结构复杂，呈多个茎环组成的假结样结构，因而可能更具有稳定性。由于HDV与HBV的特殊关系，使得HDV核酶用于HBV的治疗成为可能，本课题将就HDV核酶抑制HBV基因表达的特异性进行研究。通过在HBV全基因组保守区内设计针对于各个区域的潜在反式HDV核酶靶位点，以针对于HCV的反式HDV核酶靶位作为实验对照，筛选出高特异

5、性和高抑制率的反式HDV核酶靶位。同时通过延长靶位长度，观察长度增加是否能增加HDV核酶抑制靶基因表达的特异性。将筛选出高特异性和高抑制率的HDV核酶靶位重组入逆转录4山东省医学科学院2006届硕士研究生学位论文病毒载体中，为进一步研究重组逆转录病毒载体抑制HBV表达的研究奠定基础。研究方法1．反式HDV核酶靶位的筛选：通过HBV全基因组序列比对分析，筛选出HBV基因保守区，同时结合HDV核酶设计原则及参考文献，设计针对HBV各个基因区的5个反式HDV核酶靶位，同时设计有针对HCV的反式HDV核酶靶位点作为核酶特异性对照，PUC-U6作为载体对照。2．反式HDV核酶重组载体的构建

6、：通过基因重组方法构建针对HBV和HCV靶位的反式HDV核酶，利用PCR、酶切及部分测序等方法鉴定。3．利用正交设计方法在96孔板内优化细胞转染条件，各个因素设4个梯度。其中细胞密度梯度为0．6×105-4．8x10S／mL，质粒梯度为32--500ng，脂质体梯度为O．25．1．5“L。4．反式HDV核酶靶位点的筛选：利用优化的细胞转染条件，将反式HDV核酶重组载体转染至HepG2215细胞，48小时后经ELISA方法分析细胞培养上清中HBV的HBsAg和HBeAg的表达结果：Western-Blot检测细胞中HBV的HBsAg、HBcAg的表达结果并进行数据分析，筛选出高特异

7、性和高抑制率的反式HDV核酶靶位点。5．反式HDV核酶的特异性分析：如果构建的反式HDV核酶重组载体抑制效率低，与对照组相比没有特异性，贝q选择部分反式HDv核酶将靶位结合区域由7bp延伸至12bp，利用ELISA、Western．Blot等方法检测靶位延长前后反式HDV核酶重组载体抑制HBV基因表达的变化。6．MTI'法鉴定反式HDV核酶对细胞生长的影响和毒性作用。细胞密度设为0．9X105--7．2X105／mL等四个梯度，经生长曲线分析选取合适的细胞密度，针对于HBVP、C