应用膜片钳技术对人食管下括约肌钙离子通道的研究

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时间:2019-02-02

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下,由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试验材料、原始数据j申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相应的法律责任。研究生签名:寸壬零导师签名:V一、y院领导签名:训龆年3月甜El研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢等

2、内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。研究生签名:哥士多导师签名:知氓裤歹月刀日中文摘要应用膜片钳技术对人食管下括约肌钙离子通道的研究摘要目的:医学界对食管下括约肌(10weresophagealsphincter,LES)是否存在及其结构特点的探讨经历了一个很长的发展过程。直到1979年,Liebermann—Meffert等学者通过对32例尸体标本的解剖研究,详细阐述了食管胃连接部(esophagogastricjunction,EGJ)平滑肌束的宏观排列

3、,提出人类LES的肌肉系统由套索纤维(slingfibers)矛N钩状纤维(claspfibers)共同构成。钩状纤维位于LES右侧,呈半环形,套索纤维是一组不完整的U形肌束悬挂于胃食管交界部,食管下端的左侧,His角上方。它的开口侧位于胃小弯,闭口侧位于胃大弯。这两束肌肉共同维持LES的关闭状态,并形成了LES高压带(hi曲.pressurezone,HPZ,15~30mmHg)。这一理论为进一步研究LES的生理、病理和药理学特性奠定了基础。随后学者们主要对不同动物LES的生理学特点和功能调节进行了较为深入的探讨,发现LES

4、具有明显不同于其它平滑肌结构的特性。而且更为重要的是,构成LES的套索纤维和钩状纤维在诸多方面也存在着很大的差异性。因此,LES结构或功能状态的异常是多种食管疾病的病理基础。现在一般认为,平滑肌细胞胞浆游离Ca2+在平滑肌收缩过程中起重要的“第二信使”作用。平滑肌细胞的收缩活动依赖胞浆中Ca2+的浓度,高浓度Ca2+引起平滑肌收缩,低浓度Ca2+引起平滑肌舒张。平滑肌收缩时的Ca2+来源于细胞外中文摘要液Ca2+内流和细胞内钙库Ca2+释放(主要是肌质网,SR)。胞外Ca2+可通过质膜钙离子通道进入细胞;胞内Ca2+的释放也通

5、过钙离子通道。钙离子通道存在于所有可兴奋细胞以及一些非兴奋细胞乃至原核生物。同骨骼肌、心肌类似,钙通道对内脏平滑肌细胞的舒缩起着举足轻重的作用。而平滑肌细胞膜L型钙通道在平滑肌兴奋.收缩耦联中起重要作用,当平滑肌细胞膜去极化时,通过L型钙通道流入细胞内的Ca2+是平滑肌细胞收缩的触发因素。本研究应用细胞膜片钳技术(patchclamptechnique)对人类LES平滑肌细胞膜上钙离子通道的类型及常见的影响因素进行分析,并深入探讨构成LES的套索纤维和钩状纤维可能具有的不同生物学特征及其内在机制。可以设想,对LES的深入研究将

6、大大有助于对贲门失弛症、食管下括约肌高压症等食管运动功能障碍性疾病,以及胃食管反流病(gastroesophagealrefluxdisease,GERD)等食管良性疾病病因和病理学的理解以及治疗方法的选择。方法:选取2007年1月至2007年12月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者22例,其中男性13例,女性9例,平均年龄57.3岁。手术室采集新鲜手术标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维、钩状纤维的肌条,将肌条剪成2mm3的小块,用含胶原酶II和木瓜酶的细胞分离液分离出单个平

7、滑肌细胞。确认分离细胞活性在95%以上。然后用37℃Hepes缓冲液悬浮备用。细胞存活率测定:取5滴细胞悬浮液,加1滴O.2%的台盼蓝溶液,混匀3min内计数,当细胞死亡时将被染成红色,中文摘要活细胞无色。用以下公式计算细胞存活率:存活率(%)=活性细胞总数P/(活性细胞数+死细胞数)×100%。将细胞灌流槽固定于倒置显微镜的工作台上,吸取急性分离的平滑肌细胞悬液数滴于灌流槽中,待细胞贴壁后,用钙电流相应的灌流液灌流,选取表面光洁、边缘整齐,光滑的,静止不动,立体感强的细胞为研究对象。记录电极由硬质玻璃毛坯经水平拉制仪(Sut

8、terP.97,USA)四步拉制而成,内充钙离子电极内液后阻抗为2-3MQ。采用三维液压微操纵器将电极靠近细胞进行封接,负压吸引致封接阻抗达1GQ以上,吸破细胞膜,补偿电容电流和电极串联电阻,形成全细胞记录模式。脉冲信号由pulse+pulsefit软件(HEKA,versi

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