大岩桐spy同源基因的克隆与功能的初步分析

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1、杭州师范大学硕士学位论文大岩桐SPY同源基因的克隆及功能的初步分析摘要赤霉素是一种重要的植物激素，它参与植物生长发育的大部分过程，包括种子萌发，茎的伸长，花及果实的发育等。用赤霉素合成、赤霉素信号转导的突变体来研究赤霉素在花发育中的作用，已取得了很大进展。大岩桐是苦苣苔科的一种日中性植物，开花无需春化作用，从播种到开花仅需3-4个月。我们在以前的研究中发现，赤霉素和细胞分裂素能协同促进离体培养的大岩桐花被直接再生花芽。由大岩桐的特性及花被再生花芽的特点来看，以大岩桐花被切块再生花系统研究GA在花芽分化中的分子机制，可简化环境因素的影响，便于开展单因子实验。SPINDLY（SP

2、Y）是赤霉素信号转导的负调控因子，同时又可能是细胞分裂素信号转导的正调控因子。为了进一步探讨SPY在大岩桐花芽分化中的作用，我们利用RACE方法克隆了大岩桐SPY的同源基因。并通过农杆菌介导法成功转化大岩桐和烟草，初步分析了大岩桐SPY基因的功能。主要实验成果如下：1.比较多个物种的SPY基因序列，根据相对保守的核苷酸序列设计引物，利用RACE技术从大岩桐中克隆到了SPY基因的全长cDNA，并命名为SsSPY,在Genbank中登录号为：EU878416。序列分析表明，该基因包含一个完整的ORF，长为2805bp，编码934个氨基酸。N端为10个重复的TPR结构。与矮牵牛的P

3、hSPY基因、拟南芥的SPY基因同源性最高,分别为80%、76%。蛋白质同源性分析也表明其与SPY类基因具有进化上的相关性。2.通过RT-PCR对该基因的表达进行了分析，发现SsSPY基因在大岩桐的根、茎、叶、花、大花芽和幼花芽中均有表达。结合拟南芥中SPY的表达部位，说明SsSPY可能在植物的整个生命周期都起作用。3.利用SmaI/SacI和XbaI/SacI双酶切，成功构建了植物表达载体pBI121-SPY和pBI121-TPR，并转化农杆菌GV3101和EHA105。4.对大岩桐的Kan筛选压进行了鉴定，确定其合适的筛选压为30mg/L。利用农杆菌介导法，将表达载体pB

4、I121-SPY和pBI121-TPR转化大岩桐，获得转基因苗。经PCR检测，其转化效率分别为22.22%和11.11%。5.利用农杆菌介导，将表达载体pBI121-SPY和pBI121-TPR转化烟草，获得转基因植株。经PCR和RT-PCR检测，其转化效率分别为95.65%和100%，并且基本都能表达。通过表型分析发现，转基因植株与野生型相比株型更高、节间变长、花期提前、分枝增多。关键词：大岩桐；赤霉素信号转导；SPY基因；基因克隆；基因转化I杭州师范大学硕士学位论文大岩桐SPY同源基因的克隆及功能的初步分析AbstractGibberellins(GAs)areimpor

5、tantplanthormonesthathavebeenshowntoparticipateinmoststagesofplantdevelopmentincludingseedgermination,stemelongation,flowerandfruitdevelopmentandsoon.Sinningiaspeciosaisaday-neutralplant.Vernalizationisnotrequriedforflowering.Itneedthreetofourmouthfromseedingtoflowering.Resultsofourprevious

6、studyshowedthattheinvitroculturesofperianthcandirectlyregeneratefloralbudsinSinningiaspeciosawhenthegibberellinandcytokininexisted.SPINDLY（SPY）isnotonlyanegativeregulatorofgibberellinsignaltransduction,butalsoisapositiveregulatorofcytokininsignaling.ToexploretheroleofSPINDLYinfloralbuddiffe

7、rentiationinS.speciosa,weclonedthehomogenousgeneofSPYfromSinningiaspeciosa.SPYfunctionhavebeenanalyesed.Mainresearchresultsareasfollows:1.PrimersweredesignedaccordingtotheconservedsequencesinSPYofdifferentplants.Onefull-lengthcDNAs,namedSsSPY,wasclonedfr