急性呼吸道感染儿童hbov和hcov-229e的实时荧光定量pcr检测及临床分析

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1、福建医科大学硕士学位论文急性呼吸道感染儿童HBoV和HCoV-229E的实时荧光定量PCR检测及临床分析姓名：周建林申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：伍严安20090301急性呼吸道感染儿童HBoV和HCoV-229E的实时荧光定量PCR检测及临床分析中文摘要目的分别建立人类博卡病毒(HumanBocavirus，HBoV)、人类冠状病毒229E(HumanCoronavirus229E，HCoV-229E)的实时荧光定量PCR(real．timeFluorescentQuantitativePCRFQ．PCR)检测方法，检测呼吸道感染患儿标本的HBoV、HCoV-229E，

2、并探索其临床意义。方法分别根据HBoVNPl基因、HCoV-229EM基因的保守序列设计引物和Taqman探针，扩增NPl基因、M基因片段，并将其克隆到pGEMT-Easy载体上，构建质粒标准品；建立FQ．PCR检测方法，建立标准曲线，进行敏感性、特异性、重复性试验；检测收集到的195例临床标本中HBoV、HCoV-229E的感染情况，同时用普通PCR检测这195例临床标本中的HBoV、HCoV-229E；将FQ．PCR结果与普通PCR结果进行比较分析。结果1．FQ．PCR系统用于检测HBoVNPl基因，灵敏度为101copies／I．tl；对临床其他常见呼吸道病毒不出现特异性扩增曲线；批

3、内变异系数为O．13％，批间变异系数为0．14％。2．用FQ．PCR检测195例临床标本，共检出HBoV阳性12例(6．2％)。普通PCR检测结果与FQ．PCR检测结果一致。3．12例HBoV阳性标本中，患儿的年龄均为4岁以下，急性下呼吸道感染组阳性率为15．6％(10／64)，显著高于急性上呼吸道感染组的1．5％(2／131)(X2=12．45，P<0．005)。4．FQ-PCR系统用于检测HCoV-229EM基因，灵敏度为101copies／lxl；对临床其他常见呼吸道病毒不出现特异性扩增曲线；批内变异系数为0．4％，批间变异系数为0．7％。5．用FQ．PCR检测195例临床标本，HC

4、oV-229E阳性2例(1．0％)。普通PCR4检测结果与FQ．PCR检测结果一致。6．两例HCoV-229E阳性标本均为急性下呼吸道感染的患儿。结论1．本研究建立的HBoV、HCoV-229E的FQ．PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性均较好，可用于临床呼吸道标本的检测以及HBoV与HCoV-229E的流行病学监测。2．福州地区冬春季急性下呼吸道感染患儿中，存在HBoV、HCoV-229E感染。HBoV主要引起4岁以下婴幼儿的急性下呼吸道感染。【关键词】人类博卡病毒人类冠状病毒229E儿童急性呼吸道感染实时荧光定量PCR福州DetectionandAnalysisofHBoVandHCo

5、V-229EinChildrenwithAcuteRespiratoryTractInfectionsbyFQ·PCR[Abstract]objectiveToestablishtworeal—timeFluorescentQuantitativePCR(FQ·PCR)assaysseparatelyforHumanBocavirus(HBoV)andHumanCoronavirus229E(HCoV-229E)，andtodetectHBoVandHCoV-229Efromnasopharyngealsamplesofchildrenwithacuterespiratorytractin

6、fections(ARTI)．MethodsThespecificprimersandTaqmanprobesweredesignedtargetingtheHBoVNP1geneandHCoV-229EMgenerespectively．TheaimedfragmentsofNP1geneandHCoV-229EMgenewereamplifiedwithPCRandligatedintopGEMT-Easyvectorforstandards．TwoassaysfordetectionofNP1geneandMgeneusingFQ·PCRwereestablishedseparate

7、lyafterdeterminationofthesensitivityandspecificityofthetests，and195clinicalspecimensfromchildrenwithARTlweresubsequentlytested．TwogeneralPCRsalsodevelopedandusedtodetectHBoVandHCoV-229Einthe195clinicalspecimens．R