姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步的研究

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2、llI⋯川⋯⋯⋯1111llY1900805中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7丹IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18讨

3、论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22综述姜黄素的研究进展及在眼科临床的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37—中文摘要姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究摘要角膜受到创伤或手术后，受损的上皮细胞诱导角膜浅基质层细胞凋亡，新形成的角膜基质胶原纤维紊乱排列，邻近的角膜细胞活化并增殖为成纤维细胞，活化的成纤维细胞向伤口处移行，即构成了

4、不透明的角膜瘢痕组织，并完成角膜伤口愈合过程。其中活跃增生的角膜基质细胞在纤维化过程中发挥重要作用。然而，角膜过度纤维化会导致瘢痕形成严重，降低角膜透明度，如瘢痕位于角膜中央，则会严重影响视功能。目前，用于控制角膜过度纤维化的药物主要有皮质类固醇和抗代谢药物等，但由于具有明显的副作用而限制了它们的临床应用。因此，寻找安全有效的控制角膜基质细胞过度纤维化的药物一直是角膜创伤愈合研究和临床工作中的重要课题。姜黄素(curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种植物多酚，其药理作用尤其抗纤维化作用逐渐引起人们的重视，成为研究热点。有研究表明，姜黄素可明显减轻肺纤维化、肝纤维化

5、和肾纤维化程度【l】，但有关姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。本研究预培养离体小鼠角膜基质细胞，并将不同质量浓度的姜黄素分别作用于小鼠角膜基质细胞向角膜基质成纤维细胞方向转化的过程中，用逆转录聚合酶链式反应法(reverse仃anscriptionPCR，RT．PCR)、MTS法及免疫荧光法等观察不同质量浓度姜黄素对这一过程的影响，以探讨姜黄素的抗角膜基质纤维化的作用，为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。’目的：观察不同质量浓度姜黄素对这一过程的影响，以探讨姜黄素的抗角膜基质纤维化的作用，为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。方法：．1选取清洁级健康B

6、ALB／c小鼠，6．8周龄，体重25—309，雌雄不限，无眼部疾病。将小鼠断颈处死，眼球剜出后置于含4g／L庆大霉素的PBS中浸泡15min。无菌环境下，将角膜沿角巩膜缘剪下，置于含20IIⅡIlol／L乙二胺四乙酸(EDTANA2)的PBS中，37℃条件下孵育45min。手术显微镜下，用显微镊子撕除角膜上皮以及内皮后，将角膜基质置于含3×105肌I型胶原酶的DMEM中，37℃条件下消化4h后离心，再将角中文摘要膜基质细胞重悬于D砸M中。在光学显微镜下观察该原代角膜基质细胞的形态学特征。2以原代角膜基质细胞为受试对象，DMEM+lO％FBS做为诱导剂，将原代角膜基质细胞

7、以相同数量级(5×104个／L)培养于以下五组培养液中：(1)对照组：即角膜基质细胞诱导组(DⅧM+10％FBS，含1％oDMSO)。(2)低剂量组(DMEM+10％FBS+7．5n儿姜黄素，含l‰DMSO)。(3)中剂量组(DMEM+10％FBs+10II儿姜黄素，含l‰DMSO)。(4)高剂量组(DⅧM+lO％FBS+12．5m／L姜黄素，含1％oDMSO)。(5)E．无诱导剂组：即原代角膜基质细胞组(DⅧM，含1‰DMSO)。每3天换液一次，培养周期为7d。药物分别作用7天后，应用ImPCR法，分别提取以上五组细胞的砌蛆，并进行反转录获取cⅨ蛆。PCR扩增相关的细

8、胞标志性基因：角膜蛋白多糖(keratocall)、醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，ALD四、CD90、dec嘶n、舶roneCtill．1(引物见表1)。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后成像。观察不同质量浓度姜黄素作用下各细胞表型表达的变化趋势。3将原代角膜基质细胞以5×104个／ml接种于96孔板中，以上述A、B、C、D组培养液作用7d后，每孔加入新配制的MTS20山(59／L)，4h后弃去上清，用酶联免疫检测仪在490眦波长测定各孔的吸光度值(～90)。每组设平行复孔6个，重复实验3次。计算上述各组中姜黄素对角