产壳聚糖酶细菌的筛选及其对绿豆和黄瓜立枯病的生物防治

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1、关于学位论文独立完成和内容创新的声明本人向河南大学提出硕士擎住申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成酌，对所研究的课题有新的见解。播裁所知。除文中特别加以说明、标泣和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发裹或撰写过的研冤成果．也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学住或证书雨段保冉、汇蝠学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容妁学位论文在解密后适用本授掇书)学位获得者(学位论文作者)签名：．纽数：豳20D7卑6月伽。学位论．．--t．-t旨导教师鍪名2C妻型河南大学2007届硕士研究生学位论文摘要壳聚糖酶专

2、一性地水解壳聚糖，生成的壳寡糖具有独特的生理活性和功能，广泛应用于工业、农业和环境保护等多个领域。壳寡塘作为一个激发子，在植物和病原性真菌之间扮演着重要的角色。壳寡糖具有抑制真菌的生长，诱导植物产生病程相关蛋白(PR蛋白)，包括B-1，3．葡聚糖酶、几丁质酶和壳聚糖酶等。一定条件下，壳聚糖酶可以通过直接抑制病原真菌生长和间接诱发植物产生抗病性来控制植物病害。本研究的主要目的是分离筛选高产壳聚糖酶的微生物菌株，优化产酶的发酵条件以及实现壳聚糖酶的纯化和解析该酶的酶学特性，在此基础上研究该菌株及其所产壳聚糖酶对两种作物立枯的防治效果和可能的生防

3、机制。以壳聚糖为唯一碳源，通过透明圈法对100株植物内生细菌进行筛选，根据菌株所产透明圈的直径与菌落直径的比值，获得15株具有较好产酶能力的细菌。摇瓶液体培养复筛表明，K7菌株的酶活最高，酶活力为1．17Ⅲ,nol／mL。通过生理生化实验，结合菌株形态特征观察初步鉴定K7菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。分别对K7菌株产壳聚糖酶发酵过程中的温度、培养时间、转速和装液量等参数进行了优化，优化结果显示，在培养温度为30"(2，转速为200rpm条件下，菌株经培养24h后，以l％的接种量接入到100mLLB培养基中继续培养30

4、h，获得最高的产酶活力，为17．41pmoFmL，是优化前酶活力的14．90倍。将K7菌株的发酵液离心后所得粗酶液经硫酸铵沉淀，使之达到80％的饱和度后，利用SephadexG．100柱层析进一步纯化。获得2种活性组分，将对应于第一个洗脱峰洗脱液合并，经SDS-PAGE电泳后初步确定其分子量处于40KD-43KD之间。该酶对胶体壳聚糖、羧甲基纤维素(CMC)有降解能力，对胶体几丁质没有降解能力。摇瓶培养表明，该菌壳聚糖酶的产生不需要壳聚糖诱导。K7菌株所产的壳聚糖酶作用于脱乙酰度90％的壳聚糖较好的反应条件是：最适pH值为5．6，最适温度为

5、55℃，反应时间15rain。对峙法测定了PDA平板上K7菌株及其壳聚糖酶对立枯丝核菌(RhizoctoniasolanO抑制作用，发现K7菌株和壳聚糖酶都能够直接抑制病菌的生长。植物活体上测定了K7菌株以及不同稀释度的壳聚糖酶对绿豆和黄瓜两种作物立枯病的防治效果，发现K7菌株可以有效降低病害的严重度，是一株具有应用潜力的生防菌株。同时发现，不同浓度的壳聚糖酶防治立枯病存1产壳聚耱酶细菌的筛选及其对绿豆和黄瓜屯枯病的生物防治在差异，一定范围内随着酶浓度的增大，防治效果提高。推钡t．IK7菌株对立枯病的生防机制是通过产生壳聚糖酶来实现的。本研

6、究首次提出了壳聚糖酶作为一种生防因子防治立枯病的作用机制。关键词：壳聚糖酶，发酵条件，立枯丝核菌，生物防治2河南大学2007届硕士研究生学位论文AbstractChitosanaseisenzyme，whichhydrolyzechitosanmolecules，adeacctylatextderivativeofchitin,togivechitosanoligosaccharides．Thechitosanoligosaccharideshavediversephysiologicalfunctio-iLgincertaincondit

7、ionsandwerewidelyusedinthefieldsofagricuture，industryandenvironmentprotection．Asanelicitor,chitosanoligomershasallimportantrolesintheinto'actionbetweenpath·ogcnicfungianditshost．Chitesanoligomerscouldinhibitgrowthofmanypathogenicfungiandinducetheproductionofpathogenesis-re

8、latedproteinssuchasB-1，3-glucanase,chitinaseandchitos-ana鸵ctcinplants．Chitosanaseshowedac