胃癌中pten与血管生成相关因子联合表达检测与意义

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1、浙江人学硕卜1卅究生学位论文胃癌dPPTEN与血管生成相关因子联合表达检测及意义硕士：黄宣导师：宋震亚前言胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，其夕匕亡率居各种恶性肿瘤之首，为23．02％。尽管近年来胃癌的诊治水平不断提高，但其术后5年生存率仅为50％左存。摹础研究显示胃癌的发生、发展是多阶段、多步骤的过程中，不『刊的基因口J能在不同阶段起作用，涉及多种原癌基因的激活、抑癌基因的缺失和其他分子牛物学的异常有关。而胃癌新生血管形成是其发展、浸润的重要基础。囡而寻找肿瘤发生、浸润、转移的特异性指标将有助于了解胃

2、痛的生物学行为，对胃痛患者预后进行判断，并对有危险因素的患者采取更有效的治疗措施，以提高胃癌患者的术后生存率。PTEN定位于人类染色体杂和性缺失高发区10q23．3，是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有双重磷酸酶特异性。。1。研究表明，PTEN基因突变、缺失及PTEN蛋白的低表达与多种肿瘤的发生发展密切相关”～⋯，而目前关于PTEN基因与肿瘤微血管生成关系的研究极少。内皮抑素是胶原XVIII的COOH：末端片段，为迄今为止所发现的最强的内源性血管生长抑制剂之，体外和动物实验表明end

3、ostatin及其类似物在体外能有效抑制内皮细胞的生长、移行在体内显著退缩和停滞原发瘤和转移瘤的生长，且无明显耐药现象，无毒副作用”’⋯。目前国内外尚无关于抑癌基因PTEN失活对胃癌局部血管生成因子(VEGF)与抑制因子(内皮抑素)影响方面的临床研究，我们采用免疫组化SP技术检测胃癌组织PTEN、endostatin蛋白、VEGF蛋白表达和微血管密度(MVD)，探讨PTEN、endostatin表达与胃癌的发生及与临床病理特征、预后关系，以及PTEN基冈在胃癌新生血管生成过程中的作用。现将结果报告如

4、下。材料与方法1．实验材料：收集我院外科1997年2月至1999年lO月间手术切除胃癌石蜡包埋标本102例，包括癌组织及距癌灶5cm以上的癌旁组织。其中男性56例，女·

5、!'f46例，年龄23—78岁，平均53岁。根据全国胃癌协作组病理组规范进行病理诊断和分级，将胃癌按分化程度分为两型：分化好包括乳头状腺癌和管状腺痛，分化荠包括分化不良型腺癌、粘液腺癌等。根据国际抗癌联盟(UICC)胃痛TNM分期法行浙江人学坝I：@i02生学位论文临床分期。所有患者术前未接受放疗或化疗。手术标本常规固定，石蜡包埋，

6、5nm厚切片。2．方法：采用常规HE染色和免疫组织化学sP法。兔抗人PTEN、endostatin多克隆抗体购于美国santaCFUZ生物技术公司，鼠抗人VEGF、CD。单克隆抗体及染色试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。具体步骤：(1)石蜡切片57。C烤片过夜，脱蜡，梯度水化；(2)组织抗原微波修复(EDTAI作液，微波修复15分钟，室温下自然冷却)；(3)磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7．4)洗涤3次，每次5分钟：(4)每张切片加过氧化酶阻断溶液，室温孵育15分钟，以阻断内源性过氧化酶的活性，缝

7、非免疫动物血清封闭后弃液；(5)滴加一抗(PTEN、VEGIj、CD。为即用型，endostatin1：150)，置湿盒中37℃温箱孵育1小时；(6)PBS洗3次x5分钟；(7)滴加生物素标记的二抗，室温孵育15分钟；(8)PBs洗3次x5分钟；(9)每张切片9N50ul链霉素抗生物素一过氧化酶溶液，室温孵育15分钟：00)PBS洗3次x5分钟；nD然后每张切片滴9NlOOul新鲜配制的DAB溶液显色，显微镜下观察，控制反应时间；㈣苏木素对比染色，中性树胶封固。取已知含有待检抗原的切片为5FI,陛对

8、照，磷酸盐缓冲液代荷作为阴性对照。3．结果判定：1)PTEN、endostatin、VEGF阳性判定：PTEN、endostatin、VEGF蛋白阳性反应为黄到棕黄色细颗粒。PTEN定位于细胞核内，P1EN染色阳性细胞数超过观察细胞数的5％为阳性，≤5％为阴性。endostatin、VEGF染色阳性以细胞浆呈棕黄色颗粒状染色为标准，表达综合染色强度和阳性细胞数量分级；取表达最强的部位，按着色程度分级：基本未着色，染色与背景相似者为0分；着色浅，略高于背景者为1分；中度着色，明显高于背景者为2分；强染

9、色、着色深棕黄色为3分：阳性细胞百分数(<10％、1l一25％、26—50％、51％--75％，>75％)分别积分为0、】、2、3、4：并根据这两项指标的积分数之和进行定性，即两项分数之和<2分者，计为endostatin、VEGF表达阴性(一)，≥2分者为阳性(+)。2)M、，D的阳性判定：参照Weidner等”1的方法，CD。阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准；微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，只要结构不相连，其分支结构也