维甲酸受体激动剂am80调节klf5和rarα相互作用分子机制

《维甲酸受体激动剂am80调节klf5和rarα相互作用分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要维甲酸受体激动剂Am80调节KLF5与RARot相互作用的分子机制摘要目的：血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMC)的增殖和分化受由一系列调节因子构成的复杂网络所调控。在这个网络中，促增殖因子，如Krtippel样因子5(Krfippel—likefactor5，KLF5)与促分化因子，如维甲酸受体(retinoicacidreceptor,RAR)在功能上相互影响、相互制约，共同参与细胞生长、增殖、分化及凋亡等过程的调节。已经证明，KLF5通过调节

2、细胞周期调节因子的表达而促进多种细胞增殖。在心血管系统，KLF5通过促进细胞增殖而在心血管重塑过程中扮演重要的角色。RAR是～类重要的核受体，与其特异性配体结合后，通过激活或抑制一系列基因的表达而诱导细胞分化。目前已分离到三种RAR亚型：RARot，RA邸和RARe'。大量研究表明，VSMC中存在与维甲酸结合的RARot，通过该受体，维甲酸及其衍生物能促进VSMC分化，抑制其过度增殖。Nagai等人最近的研究显示，人工合成的维甲酸衍生物Am80是RARa的特异性激动剂，能通过抑制KLF5与RAR

3、ot相互作用而抑制血管内皮损伤所引起的新生内膜增生。然而，目前对Am80抑制KLF5与RARot相互作用的机制尚不清楚。本实验研究Am80与RARcc相互作用所激活的信号通路及其抑制KLF5与RARer相互作用的分子机制。方法：用贴块法分离、培养大鼠VSMC，胰蛋白酶消化中文摘要传代，取3--一5代细胞进行实验。通过免疫共沉淀研究KLF5与RARa相互作用，Westernblot分析检测Am80对KLF5和RARot表达及不同信号通路抑制剂对信号通路活化、KLF5磷酸化以及KLF5与RARa相互

4、作用的影响。结果：1Am80诱导RARot表达，抑制ⅪJ5表达2肛MAm80刺激VSMC不同时间和不同浓度Am80刺激细胞24h，RARot的表达水平呈时间和剂量依赖性升高；而KLF5的表达水平则呈时间和剂量依赖性降低。提示，Am80能诱导RARot表达，抑制KLF5表达。2Am80抑制KLF5与RARot相互作用提取被Am80刺激不同时间(O、0．5、1、2h)的VSMC总蛋白，进行交互免疫共沉淀。结果显示，在Am80刺激前后的VSMC中，KLF5和RARot均可被共沉淀，提示KLF5与RAR

5、a之间存在相互作用。Am80刺激后，免疫沉淀物中的KLF5和RARa均明显减少，说明Am80抑制二者之间的相互作用。与对照组相比，二者之间的结合在Am80刺激O．5h和1h明显降低，2h基本恢复至刺激前水平。与正常组和模型组相比，给药3天组的动物模型血管组织中，KLF5与RARot的相互作用显著减少。14天后二者之间的交互作用有所增强，但仍明显低于正常组及模型组。以上结果分别从细胞水平及整体水平证实，Am80能抑制KLF5与RARot的相互作用。3Am80通过诱导KLF5脱磷酸化抑制其与RARc

6、z的相互作用Am80作用于VSMC0．5h，KLF5的磷酸化水平迅速降低，2h回升。表明Am80能诱导KLF5快速脱磷酸化。且中文摘要KLF5的磷酸化水平变化与它和RARot的结合活性变化相一致。提示Am80通过诱导KLF5脱磷酸化抑制其与RARot的相互作用。Am80刺激VSMC0．5h，Akt的磷酸化水平明显升高，并持续至刺激后2h。与之相反，p38磷酸化水平于Am80刺激后O．5h明显降低，并持续至刺激后2h。上述结果提示，在VSMC中，Am80能激活P13K／Akt信号通路，抑制p38M

7、APK信号通路，这两条通路在Am80诱导KLF5脱磷酸及抑制KLF5与RARot相互作用过程中发挥重要的作用。4Akt抑制剂LY294002阻断Am80诱导的KLF5脱磷酸化为进一步证明Am80诱导KLF5脱磷酸化与Akt信号通路激活有关，用Akt抑制剂LY294002预处理VSMC2h，再用Am80刺激细胞1h后，检测KLF5磷酸化水平。结果显示，LY294002能明显抑制Am80诱导的KLF5脱磷酸化。同时，交互免疫共沉淀结果表明，LY294002能逆转Am80对KLF5与RARot相互结合

8、的抑制作用。上述结果进一步表明，Am80通过P13K／Akt信号通路诱导KLF5脱磷酸化，进而抑制其与RARot的相互作用。5Am80通过p38MAPK信号通路抑制KLF5磷酸化为探讨p38MAPK信号通路在KLF5磷酸化修饰中的作用，应用p38持续活化型质粒pSV-mkk6b转染VSMC，收集细胞检测KLF5磷酸化水平。结果表明，持续激活p38MAPK信号通路能明显抑制Am80诱导的KLF5脱磷酸化。用p38抑制剂SB203580(20／zM)预孵育细胞2h后，给予Am80刺激1h，收集细胞进