抗绿脓杆菌的活性物质筛选与其有效成分分析

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1、万方数据摘要摘要绿脓杆菌作为三大机会致病菌之一，对机体免疫功能低下人群有强致病性。随着免疫抑制剂、广谱抗生素、化疗和各种侵入性诊治措施增多，此菌的临床感染率逐年增高。目前抗绿脓杆菌感染的治疗主要依赖多种抗生素，然而大量绿脓杆菌多药耐药菌株近年来不断出现，使得感染后的治疗越来越困难。抗菌肽（或抗菌蛋白）是一类普遍存在于生物体内的阳离子两亲性多肽，具有抗菌谱广、作用强、起效快、不易产生耐药性等优点，已日益引起了人们的广泛关注，成为一类极具开发潜力的新型抗感染制剂。然而，目前针对绿脓杆菌的抗菌肽（抗菌蛋白）的

2、研究报道较少。本研究的主要目的是从微生物中筛选拮抗绿脓杆菌的菌株，并对其活性成分进行分离和鉴定，为将来进行新型抗绿脓杆菌药物研究奠定基础。主要研究内容：1.拮抗绿脓杆菌的微生物筛选。从土壤样品中筛选对绿脓杆菌有拮抗作用的菌株，进行形态学观察及16SrDNA序列分析，确定其分类地位。2.拮抗绿脓杆菌的活性成分表达条件优化。对不同培养基、pH值、温度和时间等条件下，抗绿脓杆菌成分的活性进行比较，获取适宜的发酵条件。3.拮抗绿脓杆菌的活性成分的纯化。收集发酵液，采用硫酸铵沉淀、离子交换、分子筛等方法从发酵上清

3、中纯化目的蛋白。4.拮抗绿脓杆菌的活性成分的特性分析。测定活性成分的酸碱稳定性，蛋白酶K敏感性，高温耐受性，分子量，等电点（pI）等特性。主要研究结果：1.从土壤样品中筛选出了5株对绿脓杆菌有拮抗作用的菌株。经菌落形态、革兰氏染色等形态学观察，16SrDNA扩增、测序及RDP序列分析，明确了所筛选的菌株分属假单胞菌属（Pseudomonadaceae）和不动细菌属（Acinetobacter）。2.以筛选出的B1505菌为供试菌，从11种培养基中优选出最适宜拮抗绿脓杆菌活性成分表达的培养基（酵母膏3g/

4、L，胰蛋白胨5g/L，NaCl3g/L，葡萄糖5g/L）。该活性成分的最适发酵pH值为7.0、最适温度为37℃。在上述条件下，250rpm培养48h-64h，发酵液拮抗绿脓杆菌的活性最强。3.发酵液分别采用饱和度60%的硫酸铵或pI6.0沉淀后，经G-75分离，获得了纯度为80%的目的蛋白。4.拮抗绿脓杆菌的活性成分的特性分析表明，该活性成分易被蛋白酶K水解，不耐高温，分子量约35KD，pI6.1，是一种抗菌蛋白。关键词：绿脓杆菌；拮抗；菌株筛选；鉴定；发酵；分离纯化I万方数据重庆理工大学硕士学位论文A

5、bstractTheratesofinfectionfromthePseudomonasaeruginosa,oneofthethreeprimaryopportunisticpathogensandstrongerpathogenicitytoimmunodeficiencypeople,graduallyrosealongwiththeoverprescriptionofimmunosuppressantandbroad-spectrumantibiotic,chemotherapyandvario

6、usinvasivetherapies.Currently,treatmentofPseudomonasaeruginosainfectionmainlyreliesonmultipleantibiotics,however,alargenumberofPseudomonasaeruginosamultidrug-resistantstrainscontinuetoemergeinrecentyears,makingtreatmentincreasinglydifficultafterinfection

7、.Antibacterialpeptides(orantibacterialprotein),awidespreadcationicamphiphilicpeptides,foundedinalllivingthings,withabroadantibacterialspectrum,fasterandstrongeronsetofaction,difficulttoproduceresistance,hasdrawnextensiveattentionandhasgreatdevelopmentpot

8、entialtobenewanti-infectiveagents.However,therearefewstudiesofantibacterialpeptides(orantibacterialprotein)forPseudomonasaeruginosahavebeenreported.Themainpurposeofthisprojectwastoscreenstrains,haveantagonismeffectonPseudo