聚焦超声治疗乳腺增生的实验分析和初步临床观察

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分兔乳腺增生模型的快速制备乳腺增生患病率居中青年妇女乳腺疾病首位【引，该病病程长，易复发；疗程长，治疗相对困难，部分类型有一定的恶变风险，威胁广大妇女的身心健康。国内曾试验多种疗法，常需建立动物模型；但建模周期较长【9。1¨，较少报道病理类型及维持时间。本实验探讨快速建立兔乳腺增生模型，并分析病理类型及维持时间。l材料和方法1．1实验动物雌性健康新西兰大白兔，未孕，体重(2．3+0．1)kg，5-6月龄，单笼饲养，自动饮水，饲喂颗粒饲料(由重庆医科大学实验动物中心提供、饲养)。1．2主要试剂及仪器苯甲酸雌二醇(上海通用

2、药业股份有限公司，批号：070902)，黄体酮(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：070904)，EnvisionTMDetectionKit，Peroxidase／DAB(DAKO公司，批号：GK500705)，ERa抗体(LabVision公司，批号：Cat．#RB．1521一P0)，日本奥林巴斯光学显微镜，游标卡尺，日立HITACHI一7500透射电镜。1．3乳腺增生模型的建立预实验：10只雌兔每只连续肌肉注射E2Img／(kg·d)，至14d时70％腹泻而死。将60只兔随机分为5组，第5组20只，其余每组10只。第l组为正常对照组，每兔肌注2ml生

3、理盐水，连续30d；余为模型组，每兔注射的E2剂量为0．75mg／(kg·d)，第2组连续肌注E215d；第3组连续肌注E220d；第4组连续肌注E220d，之后肌注黄体酮1mg／(kg·d)，连续5d。第5组连续肌注E225d，之后肌注黄体酮1mg／(kg·d)，连续5d。：1．4取材及检测造模后3d、1月、2月、3月、4月、4月半，以速眠新麻醉，每只兔每次随机切取1个乳腺。(1)标本用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，参照文7重庆医科大学硕士研究生学位论文献光镜下判断有无增生及类型。(2)模型评价标准：由于乳腺增生指的是上皮和间质的增生，其组

4、织学病变繁多，每例由2—7种病变组成，以其中l一2种为主；病理诊断标准至今尚未完全统一；然其基本病变是比较公认的，即小叶增生，导管增生扩张，间质增生。参照文献【12．13】的乳腺增生病理标准，若有一种基本病变为主，并有其它增生性病变，则为乳腺增生。(3)造模后3天取材，由重庆医科大学电镜室制成电镜标本，观察乳腺上皮细胞线粒体数量和间质胶原纤维。(4)取2月后标本，制成5微米石蜡切片，免疫组化Envision法，按说明书步骤测ERa，观察其分布。1．4．1免疫组化流程：常规脱蜡水化：将石蜡切片浸于二甲苯中5分钟，三次。取出切片置于100％无水乙醇中3分钟两

5、次，依次置于90％一70％各级酒精各3分钟。取出置于蒸馏水中。Envision法染色：步骤一：取出蒸馏水中的切片，甩掉并擦干切片上组织周围的液体，平放于湿盒中，滴加过氧化物酶阻断剂(常用3％过氧化氢)于组织上避光孵育15分钟，蒸馏水冲洗，再将切片置入PBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。步骤--：滴加50—100微升ERa一抗工作液(1：100，用PBS稀释)于组织上，室温孵育30分钟。用PBS冲洗切片。将切片置入PBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干

6、燥)，平放于湿盒中。步骤三：滴加A液(ChemMateTMEnVision+／HRP)于组织上，室温孵育30分钟。．用PBS冲洗切片。将切片置入PBS缓冲液中，浸泡5分钟，三次。取出切片，甩掉并擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，平放于湿盒中。步骤四：滴加预备好的显色剂DAB工作液50—100微升，光镜控制下显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。各级酒精(70％一100％)脱水，每级3分钟。取出切片置入二甲苯5分钟，三次，封片。1．4．2电镜流程(超薄切片由重庆医科大学电镜室制作)超薄切片的制作，需要取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

7、8重庆医科大学硕士研究生学位论文步骤一：取材用崭新的手术刀片取兔乳腺组织，操作宜轻，具体操作如下：蜡板可以用病理切片石蜡融化在培养皿中冷却后即可使用，同时在蜡板的下方放一些碎冰块或冰袋以适量降低固定液温度。所用的固定液、操作工具要预先冷藏，操作时环境温度较低温，以降低酶的活性，防止细胞自溶。并在其上滴几滴预冷的固定液，将取出的组织放在固定液中，用新的、锋利的手术刀片当切割刀将组织切下并修小，一般不超过lmmxlmmxlmm。避免牵拉、挫伤与挤压，然后用牙签或镊子轻轻地将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中乳腺组织从活体取下后应在最短时间内(争取在1分钟内)投

8、入(2．5州％)戊二醛固定液中进行固定。若组织带有较多的血液和组织液，先用缓冲液