金属硫蛋白在小鼠心脏缺血再灌注损伤中的保护作用

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1、贵阳医学院2013届硕士研究生论文仪器名称生产厂家型号电子天平上海奥豪斯仪器有限公司CP214超净工作台苏净集团安泰公司生产SW-CJ-1B立式高压灭菌锅上海东亚压力容器制造有限公司01J2003-04冷冻高速离心机德国ThermoD-37520恒温水浴锅金坛市科析仪器有限公司HH-6低温冰箱青岛海尔股份有限公司BCD-206TM紫外分光光度计北京普析通仪器TU-1810恒温培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司SPX-250BS-Ⅱ原子吸收分光光度仪美国PE公司AA800型质谱仪布鲁克道尔顿有限公司ultrafleXtreme超纯水系统北京北瑞达医疗科技有限公司ACY-100

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3、/L。分装于玻璃试管，倾斜冷却凝固，121℃灭菌30min；液体/发酵培养基：8贵阳医学院2013届硕士研究生论文成分含量蛋白胨5g/L酵母粉5g/L葡萄糖20g/LKH2PO45g/LMgSO45g/L表1-1配置液体/发酵培养基，充分溶解混匀后，以200ml/瓶分装于500ml[9]锥形瓶内。121℃灭菌30min备用。成分含量蛋白胨5g/L酵母粉5g/L葡萄糖20g/LKH2PO45g/LMgSO45g/L表1-1液体/发酵培养基配伍表2.4实验过程2.4.1菌种活化将保藏的菌种接种于试管斜面PDA培养基中,25℃培养8天后，置与4℃保3存备用。将活化好的菌种接入液体

4、培养基锥形瓶中,每瓶接0.5cm大小菌种一块，置于25℃，150rpm摇床环境中培养，制备虫草种液。2.4.2硫酸锌诱导虫草金属硫蛋白9贵阳医学院2013届硕士研究生论文在液体/发酵培养基中按照0g/L~20g/L,梯度为1g/L，加入金属硫蛋白诱导剂ZnSO4。以200ml/瓶分装于500ml锥形瓶内。121℃灭菌30min备用。每瓶接种种液5ml，置于25℃，150rpm摇床环境中培养,培养7天，并肉眼观察菌种发酵情况。2.4.3金属硫蛋白的粗提取将经含ZnSO4诱导培养的的九州虫草菌丝体用砂型漏斗抽滤除去液体培养基，后用无菌去离子水冲洗3-4次，抽干得到菌丝体。将菌丝

5、体平铺于滤纸上，置于40℃烘箱烘干菌体外水分，得到纯菌丝体湿样。收集菌丝体湿样，称重，按2ml/g加入0.05mol/L、pH8.2的Tris-HCl溶液，,搅拌约5min。使用超声波破碎仪破碎细胞。加入与菌丝/Tris-HCl溶液混合物体积相等的氯仿∶乙醇(0.08∶1)混合溶液,搅拌约5min以变性除去杂蛋白。9000rpm、4℃离心25min,取上清液。80℃热变性15min，除杂蛋白后用冰水混合物迅速冷却，静置30min。10000rpm、4℃离心25min,取上清液,得到金属硫蛋白的粗提液。对粗提液进行紫外区连续扫描，210nm-320nm，间隔为0.5nm；然后

6、调PH至2，同样在紫外区连续扫描。得到其粗提液的紫外吸收光谱特征图。2.4.4金属硫蛋白的精细纯化使用SephadexG-50柱(4.5cm×100cm)对粗体液进行分离,分离后用0.05mol/LTris-HCl,pH8.6缓冲液进行洗脱，收集含有MT组成分的层析液，后将所得到的样品液行254nm紫外分光光度吸收和锌原子吸收检测（测试条件为：波长239.5nm，狭缝3mm，灯电流5mA，灯电压170V，空气流量0.15MPa/min，乙炔流量0.05MPa/min），绘制曲线，分析纯化后的金属硫蛋白组分。10贵阳医学院2013届硕士研究生论文将经SephadexG-50分

7、离纯化得到的金属硫蛋白组分，收集起来并经真空冷冻干燥仪得到其固体粉末，称重。2.4.5金属锌含量的测定：菌丝体锌含量的测定：取0.1g菌丝体湿样加入10mL的浓硝酸/高氯酸(体积分数)为4：1的消化液，在沸水浴中加热至澄清,用去离子水在100mL容量瓶中定容后采用原子吸收分光光度仪进行测定。九州虫草金属硫蛋白锌含量的测定：取金属硫蛋白冻干粉0.2mg，溶于Tris-HCl缓冲液中，采用原子吸收分光光度仪进行测定。2.4.6巯基含量的测定：用Ellman’s方法测定巯基含量:将金属硫蛋白冻干粉0.2mg，溶于200M