黄曲霉毒素b1胶体金免疫层析试纸条研制

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1、摘要III黄曲霉毒素B1(aflatoxinB，AFBl)是寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和黄曲霉(A．flavu)的二次代谢产物，具有很强的致癌性。许多粮油食品、饲料等都容易被AFBl污染，严重威胁人类健康和畜禽生产。几乎所有国家和地区都规定了农产品、食品和饲料中AFBl的最大允许含量，并作为强制性检测标准进行检测。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，无法满足现场快速检测的要求，因此建立简单、快速、高效的AFBl检测方法具有重要的意义。本研究以单克隆抗体(McAb)和免疫胶体金标记技术(ILT)为基

2、础，根据竞争抑制原理，成功研制了AFBl胶体金免疫层析试纸条，其灵敏度、特异性、稳定性等基本能达到检测要求。(1)将稳定分泌抗AFBl单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB／c小鼠腹腔，采用体内诱生腹水法制备抗AFBl的腹水。腹水经辛酸．硫酸铵法纯化并作质量鉴定，考马斯亮蓝法测定单抗蛋白质浓度为1．526mg／mL；酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价为1：6．4x104，IC50为0．218n∥mL；交叉反应结果表明单抗特异性良好。(2)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，以金标AFBl单克隆抗体作为探针，将AFBl一BSA(检测线

3、)和羊抗鼠IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上，构建了间接竞争胶体金免疫层析检测体系(GICA)。标记探针中金溶胶最佳粒径为24姗，最佳包被抗原浓度为0．3酬，金标单抗量为O．5lxg／mL，金标液的最佳稀释度为4倍稀释。GICA目测检出限为5ng／mL，检测时间为5～10min。试纸条对AFB2、AFMl、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮等无交叉反应，与AFGl、AFG2有明显的交叉反应。(3)在AFBl加标回收实验中，将6种不同浓度(1、2、3、5、10、20ng／mL)的AFBl标准品添加到未污染AFBl的玉米粉中，制备不同污染程度的样

4、品。分析比较GICA法和ELISA法对AFBl的检测情况。当添加的AFBl浓度低于2ng／mL时，检测线和质控线均为红色；高于3ng／mL时，仅质控线为红色，同时以ELISA法做验证实验，结果表明试纸条能够基本满足检测要求。试纸条检测的最大优点是无需借助仪器，所需试剂已固定在试纸条上，检测快速、简便，lOmin内可出检测结果，适用于对AFBl进行现场检测。关键词：黄曲霉毒素B1；胶体金；免疫层析试纸条Abstrac：tVABSTRACTAflatoxinB1arecarcinogenicsecondarymetabolitesproduce

5、dprimarilybyAspergillusflavusandA．parasiticus．TheyCallbepresentingrains，nuts，cottonseedandothercommoditiesassociatedwithhumanfoodoranimalfeeds．AflatoxinB1hasbeenimplicatedinhumanhealthandanimalfeeds．So，mostcontrollinggovernmentagenciesworldwidehaveregulationsregardingtheam

6、ountofaflatoxinB1allowedinhumanandanimalfoodstuffs，anddetecteditascompellentstandard．ThedetectionmethodsofAFB1nowarecomplicatedtooperateandneedspecialinstruments，whichcannotmeettherequirementofrapiddetectiononthespot．Therefore，developmentofaconvenientandrapidmethodforAFB1d

7、etectionisextremelyimportantandnecessary．Inthisstudy,dotimmunogoldassay(DIGA)basedonmonoclonalantibody(McAb)andimmunogoldlabelingtechnique(ILT)wasdevelopedfortheAFBIdetectionaccordingtocompetitiveinhibitionprinciple．Adoptingvivoculturemethod,hyridomacell2A5capableofsecreti

8、ngMcAbagainstAFB1continually,wereinjectedintoBLAB／cmicetoproduceascites．Theascitesofthemi