索科线虫saflp亲缘关系的分析及长pcr技术在其线粒体全基因组测序中应用

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1、⑥硕士擘位论文MASTER‘STHESIS中文摘要索科线虫(Mennithidae)是一类宝贵的生防资源，某些属级的分类目前还存在一些争议，研究索科线虫的遗传背景，正确鉴定线虫种类或品系，分析不同种类线虫之间的亲缘关系，对于线虫的实际应用具有十分重要的意义。SAHP已经在分类，基因组分析、指纹图谱构建、遗传稳定性、亲缘关系的鉴定、分子标记的筛选和基因组DNA多态性分析等方面广泛应用。本实验首次将SAFLP技术应用于昆虫病原索科线虫亲缘关系研究，建立并优化了索科线虫SAFLP体系，构建了我国常见索科线虫6属10余种／亚种的指纹图谱。采用EcoR朋姐Mse，两种限制性内切酶单酶切，结

2、果显示EcoRI酶更适合作为索科线虫SAFLP的内切酶。3个带有3个选择性碱基的EcoR1引物进行扩增共得条带225个，片段大小为250～1650bp。通过NTsys-PC2．1软件计算了6属11种／亚种索科线虫的Nei．Li遗传距离(O．1980--0．4554)和相似系数，利用NTsys-PC2．1软件中的UPGMA方法构建这其聚类图。6属11种／亚种索科线虫从属级阶元可以分为两大类群：罗索属(Romanomermis)和八腱索属(Octomyomermis)聚为一支构成第一大类群；六索属(Hexamermis)与卵索属(Ovomermis)先聚在一起然后与多索属(Agame

3、rmis)聚在一起，再与两索属(Amphimermis)聚在一起构成第二大类群。在八腱索属和两索属中属内不同种／亚种间线虫采集地相距较近的其遗传距离较近。在八腱索属dO：Octomyomermissp．A+(D．huazhongens妇+Octomyomermissp．C)，在两索属中：(Amphimerm捃sp．B+Amphimermissp．A)+Amphimerm缸sp．C。优化的索科线虫SAFLP体系能够反映索科线虫种属问的亲缘关系，并与形态学的研究结果基本相符，可以用于属种的分类和亲缘关系的研究。线虫线粒体全基因组对线粒体基因组的进化，线虫系统发育、种类鉴定、分子分类，

4、以及线粒体突变相关疾病和细胞衰老、细胞凋亡等方面具有重要的研究意义．目前，国外仅对6种索科线虫线虫(Romanomermisculicivorax，足iyengari，尼nielseni，Thaumamermiscosgrovci，Agamermissp．，Hexamermisagrotis)线粒体全基因组进行了研究，国内此领域还属空白．本实验首次应用长PCR技术展开了我国索科线虫线粒体全基因组的初步研究。在前人研究基础上，设计出一套适合中华卵索线虫(Ovomermissmens西)线粒体基因组研究的实验方案。通过已经测序的线虫线粒体基因序列设计出一对引物，扩增出中华卵索线虫线⑨

5、硕士擘位论文MASTER’STHESIS粒体基因组中4．4Kb的片段，测序后根据这一片段中所包含的细胞色素b基因，设计一对引物扩增出剩下的中华卵索线虫线粒体基因，约23Kb。采用步移法对两个片段进行测序。两个片段间存在较大重复区域，根据重复区进行拼接得到中华卵索线虫线粒体全基因组。本研究从实验方法上初步探讨了长PCR技术在索科线虫线粒体基因组研究中的应用。长PCR技术对线虫DNA模板的纯度和完整性有较高要求，在综合考虑索科线虫线粒体基因存在重复、基因排序变化较大等方面的因素的基础上设计的引物能够扩增得到涵盖中华卵索线虫全基因组的片段，通过步移法澳4序，然后依据片段间的重叠区拼接得

6、到线粒体全基因组。此实验方案为本研究室全面展开我国索科线虫线粒体全基因组研究提供了一定的参考。关键词；索科线虫；SAFLP；亲缘关系；中华卵索线虫；线粒体全基因组；长PCRAbstractMermithidaeisagroupofinsect’Sparasiticnematodewitlldiversifiedmorphologicalcharactersandhostspecificity,anditisavaluablebiologicalcontroll'CSOUl℃e．Thephylogeneticrelationshipamongdifferentgeneraorspe

7、ciesisstillnotclear,studyingtheirgeneticvariationandphylogeneticevolutionisveryimportantfortheapplicationsofmermithidae．Themethodofsingle-enzymeamplifiedfragmentlengthpolymorphism(SAFLP)WasoptimizedforMermithidaeinthisstudy．Thegeneticrelation