【5A版】研究生-PCR(聚合酶链反应).ppt

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1、CHAPTER7聚合酶链反应福建医科大学分子医学研究中心医学分子生物学PCR的用途体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特异地扩增目的DNA片段。能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生物学研究提供了强大的工具。1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。发展历程1971年，Kho

2、rana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。1976年，台籍科学家钱嘉韵（AliceChien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermusaquaticus中分离出热稳定的TaqDNA聚合酶。1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polyme

3、raseChainReaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。1988年Saiki开始将耐热性TaqDNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。PCR的基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA

4、变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。待扩增片段高温变性低温退火中温延伸PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，

5、逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。PCR扩增曲线PCR反应体系与流程反应体系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR缓冲液1.5～4mMMg2+0.2mMdNTP反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止25～35循环一、PCR的反应体系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）1、引物引物：决定PCR反应的特异性PCR产物的特异性取决于

6、引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则①引物长度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效长度不能大于38bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性②引物扩增跨度：以500bp为宜—特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜—G+C太少扩增效果不佳，G+

7、C过多易出现非特异条带—ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸④避免引物内部出现二级结构和引物间互补—特别避免3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）—特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物5′端可修饰—引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加

8、10个碱基而对PCR反应无影响3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记⑦引物的特异性：—引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：—每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且