acapc2蛋白的纯化及其抗肿瘤作用机制的初步研究

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1、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人和在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。研究生：—}恤宝2007年4月20Et导肌lk男2007年4月20同四川大学博士学位论文AcAPc2蛋白的纯化及其抗肿瘤作用机制的初步研究研究生：童煜导师：张思仲研究员中文摘

2、要犬钩虫抗凝血肽c2似ncylostomacaninumantieoagulantpeptidec2，AcAPc2)是从吸血寄生虫——犬钩虫似ncylostomacaninum)中分离出来的一种具有抑制组织因子．VIIa复合物(fvIIa／TF)的蛋白。它通过结合于fXa的催化活性中心以外的部位而进一步特异性抑制fVIIa／TF复合物。由于ⅣIIa／TF复合物在凝血级联反应中起关键作用，因此AcAPe2可有效地抑制凝血。AeAPc2首先是由Stanssens等利用分子克隆技术分离出来的，它由84个氨基酸组成。尽管已有报道表明AcAPc2已实现了在Ecoli和酵母中表达，然而

3、该重组蛋白与天然的AcAPc2氨基酸序列存在一定的差异，这在一定程度上会影响目的蛋白的空间结构，进而影响蛋白的功能。到目前为止，利用基因工程的方法表达与天然AcAPc2氨基酸序列相同的AcAPc2(rAcAPc2)无文献报道。蛋白质剪接(proteinsplicing)是在蛋白质内含肽(intein)的自我催化作用下从翻译后的蛋白质前体中切除蛋白质内含肽，同时两侧的蛋白质外显肽(extein)通过连接反应形成一个新的具有生物活性的蛋白质。intein对于蛋白质工程来说是～个功能强大的工具。Intein与ex．tein几乎没有序列同源性，天然的extein常常可以替换成外源的

4、蛋白质而不影响intein的剪切活性。这一点是以intein作为融合蛋白进行蛋白质纯化的理论基四川大学博士学位论文础。m们PAcl一．Tw矾系统利用intein的自剪切实现了蛋白的纯化。利用这一系统可以得到与天然蛋白序列一致的重组蛋白质。本研究利用pTWINl表达载体，根据AcAPc2蛋白的氨基酸序列设计引物，利用引物搭桥PCR的方法合成AcAPc2的全长eDNA序列，成功构建了AcAPe2原核表达载体pTWINl一AcAPe2，实现了AcAPc2在大肠杆菌中的高效表达。利用pTWINl载体的SSPdnaBintein的自剪切和CBD与几丁质的紧密结合，获得了具有抗凝活性的

5、、与天然AcAPc2蛋白氨基酸序列一致的rAcAPc2蛋白。丝氨酸蛋白酶参与体内各种生命活动的调控，调节生物体内许多重要的生命过程。研究表明某些丝氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，并且可以诱导某些肿瘤细胞的凋亡。作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一，AeAPC2可能会对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本研究通过SRB染色法发现，rAcAPe2蛋白能剂量依赖性地抑制人肺癌细胞NCI—H460的体外增殖。在rAeAPc2浓度达到100gg／ml时，NCI-H460细胞生长抑制率达到69％。随后的DAPI染色、TUNEL和流式细胞术检测结果表明rAcAPc2能够诱导NCI—H

6、460细胞发生凋亡。有资料显示uPA／uPAR在恶性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织和良性肿瘤，其表达水平与患者的预后有关。因此，uPA／uPAR系统被认为在肿瘤的生长、侵袭、转移过程中具有重要作用。2006年，Subramanianeta1．报道uPA／uPAR转录水平的下调可以直接诱导细胞凋亡【26】。有鉴于此，我们采用RT-PCR的方法，检测经rAcAPe2蛋白处理的NCI-H460细胞(rAcAPc2+)的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase·typeplasminogenactivator，uPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(urokinase．typep

7、lasminogenactivatorreceptor，uPAR)的mRNA表达情况，结果显示：随着rAeAPc2剂量的增高，NCI-H460细胞uPA和uPAR的mRNA表达2四川大学博士学位论文水平随之降低。已经证实，细胞内uPA蛋白合成增加主要是由基因转录水平引起的，转录因子NF-KB在uPA和uPAR基因表达调控中起重要作用，它可以增加uPA和uPAR的转录表达，从而促进肿瘤细胞侵袭转移。NF—rB参与肿瘤细胞的增殖和抗凋亡作用过程，这是以NF—rB的活化为前提的。活化的NF—rB可以上调一系列抗凋亡基因转