rna激活介导e-钙粘蛋白上调表达抗肿瘤作用及其机制的研究

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1、浙江人学博I：学位论义中文摘要RNA激活介导E．钙粘蛋白上调表达的抗肿瘤作用及其机制研究浙江大学医学院博士研究生导师中文摘要外科学(泌尿外科)毛祺琦谢立平第一部分小激活RNA的设计与筛选目的基于小激活RNAs(saRNAs)的肿瘤治疗策略，为p12、p27、p57三个抑癌基因筛选出具有激活功能并相对高效的候选saRNAs分子。方法利用国外文献提供的saRNA设计规则，为每个靶基因设计2～3对候选saRNA分子，对照组双链RNA设计成与人基因组序列非同源。将上述合成的候选saRNAs分子转染膀胱癌5637、T24细胞系或前列腺癌P

2、C3、DUl45细胞系，每一种细胞系均包括对照组(转染对照组saRNAs)和saRNAs组(转染候选saRNAs)．利用RT-PCR法检测转染后靶基因mRNA表达水平，根据靶基因表达水平筛选出功能性saRNAs，我们将“功能性saRNAs”定义为使靶基因mRNA表达量增加至少两倍(RT-PCR法)。．结果转染各候选saRNAs后各靶基因mRNA的表达水平相对于对照组无明显增强，没有达到“功能性saRNAs”的标准。结论saRNAs的筛选还比较困难，其设计规则有待进一步完善。浙江大学博t：学位论文中j[摘要第二部分E．钙粘蛋白小激

3、活RNA的抗肿瘤作用目的评价已证实的E．钙粘蛋白(E．cadherin)小激活RNA(dsEcad一215)对膀胱癌5637细胞及前列腺癌PC3细胞的肿瘤抑制作用。方法将与E—cadherin基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子(dsEcad．215)分别转染入5637细胞和PC3细胞中，采用RT-PCR法及Westernblotting法检测E．cadherin在mRNA及蛋白水平上的表达；采用Transwell小室法及划痕法检测dsEcad-215转染后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的改变。结果dsEcad．215转染5637细

4、胞和PC3细胞72h后E．cadherin表达显著上调，RNAa有效；5637细胞和PC3细胞对细胞外基质的侵袭能力及迁移能力也明显下降。结论RNAa技术激活E．cadherin基因表达并抑制膀胱癌及前列腺癌细胞侵袭、转移等恶性行为，可作为恶性肿瘤基因治疗的一种有效手段。第三部分小激活RNA上调E．钙粘蛋白表达的机制研究目的探讨dsEcad．215上调E．cadherin基因表达的相关分子机制方法采用基因特异性RT-PCR检测5637细胞E．cadherin启动子相关非编码正义或反义RNA的表达，以及dsEcad一215转染后其

5、表达量的变化；利用染色质免疫共沉淀技术检测dsEcad．215转染后E—cadherin启动子区域相关组蛋白修饰状态的变化；采用RT-PCR法检测dsEcad．215作用后干扰素通路OASl及OAS3基因表达的变化。结果E．cadherin启动子区域存在非编码正义和反义RNA；dsEcad．215转染后E．cadherin启动子相关非编码反义和反义RNA的表达未发生明显变化，E．cadherin启动子区域组蛋白3赖氨酸9(H3K9)和组蛋白3赖氨酸4(H3K4)二甲基化的水平明显降低，干扰素通路中OASl和OAS3基因的表达没有

6、明显升高。结论dsEcad．215转染5637细胞后并没有影响非编码正义和反义RNA的表达水平，而可能与其结合后改变其空间结构和功能从而影响组蛋白甲基化的修饰，如III浙江人学博I：学位论文中文摘要H3K9和H3K4两个位点二甲基化水平减弱而激活转录。dsEcad一215没有激活干扰素途径而诱发非特异性反应。第四部分小激活RNA上调E．钙粘蛋白表达抑制肿瘤细胞侵袭及迁移的机制研究目的探讨E—cadherin上调表达抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的相关分子机制方法利用Westernblot检测Ecad一215转染后13-catenin蛋白

7、在膀胱癌5637细胞及前列腺癌PC3细胞胞膜、胞浆及胞核中表达变化；利用细胞免疫荧光法进一步验证13-eatenin蛋白在细胞内的重新分布；利用RT-PCR法检测mmp-7及cyclinD1基因mRNA的表达水平．结果dsEcad一215转染5637及PC3细胞?2h后，细胞质和胞核13-eatenin蛋白表达水平降低，胞膜肛catenin蛋白表达水平升高，而总的蛋白表达水平不变；细胞免疫荧光实验进一步证实dsEcad．215作用后13-catenin蛋白从胞质、胞核重新分布于细胞膜上．mmp．7和cycylinD1基因mRNA

8、表达水平降低．结论dsEcad一215上调E—cadherin表达，引起lB-catenin蛋白从胞核胞浆转移至胞膜，导致其靶基因转录活性降低，从而抑制肿瘤细胞侵袭。关键词：RNA激活；E-钙粘蛋白；膀胱癌；前列腺癌；侵袭IV浙江大学博t学位论近英义摘要Stud