hcmv体外感染鼠胚成纤维细胞和感染复数相关性实验的研究

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1、安徽医科大学硕士学位论文HCMV体外感染鼠胚成纤维细胞与感染复数相关性的实验研究姓名：史永林申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：王明丽;陈敬贤20070501安徽医科大学硕士学位论文英文缩写MOIbpcDNACPEDMEM‘帅GAPDHHCMⅣmⅣ艰tuRNAPBSPCRRT-PCRPFlJrpmhdmmSeC中英文缩略词表英文全称multiplicityofinfectionbasepairscomplementaryDNAcytopathiceffe虻'tdulbecco’sModifiedEaglesMedi

2、umdeDxyribonuclcosidetriphosphateglycemldehyde-3-phosphatedehydrogenasehumancytomegalovirushumanfibroblastnl(哪scfibroblastmessageRNAphospb．aie-buffcrcdsalinepolymerasechaJureactionⅢasetranscriptionPCRplaqueformationunitrevolutionperminutehourdayminutesecond中文全称感染

3、复数碱基对互补DNA细胞病变效应改良Eagles培养液脱氧核糖核苷三磷酸3．磷酸甘油醛脱氢酶人巨细胞病毒人胚成纤维细胞鼠胚成纤维细胞信使RNA磷酸缓冲盐溶液聚合酶链式反应逆转录PCR空斑形成单位每分钟转数小时天分钟秒安徽医科大学硕士学位论丈学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明井表示谢意．学砬论文作者签名：肆s朝：』学学

4、位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定．学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定．r让Z，私口、、曼知名期签日者#文沦泣学安徽医科大学硕士学位论文中文摘要HCMV体外感染鼠胚成纤维细胞与感染复数相关性的实验研究目的：研究人巨细胞病毒(humancytomegalovh-us，H

5、CMV)在体外可以增殖性感染鼠胚成纤维细胞(mouseembryofibroblast，MF)，探讨HCMV体外增殖性感染MF细胞与感染复数(multiplicityofinfection，MOI)的相关性，为HCMV跨种属感染的分子机制研究奠定实验基础。方法：HCMVADl69毒株复苏感染人胚成纤维细胞(humanembryofibroblast，ttF)，连续传代三次，待细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)达“4+”时，反复吹打使病毒释放，4℃3000rpm离心10rain，收获上清；部分上清作P

6、RJ试验测定病毒滴度，其余冻存于一80℃冰箱；设定MoI为0．1、l、lO和100，根据测定出的病毒滴度和细胞计数，算出各MOI所需病毒量，分别接种至6孔培养板对应的砸细胞和I-IF细胞上，置5％cch温箱37℃培养，次日换维持液，逐日镜下观察HCMV特征性CPE；分别在第1、2、5、7、10和14d收集细胞和培养物上清，进行下列各项实验：(1)培养物上清采用PFU试验检测其中的病毒滴度：(2)收集的细胞用于进行RT-PCR半定量检测HCMVIE和UL83基因mRNA的转录水平；(3)第14d后的细胞培养物用于抽提DNA

7、基因组，行PCR检测HCMvUL83基因验证病毒；(4)采用透射电镜观察不同MOI感染的MF和HF细胞内有无疱疹病毒样病毒颗粒形态特征，在细胞内的分布和定位以及感染的MF和I-IF细胞超微结构变化与MOI的关系。结果：以MOI为O．1和l感染MF和I-IF细胞时，IVlF细胞在2周的培养过程中没有观察到CPE的产生，I-IF细胞分别在第10d和第7d出现了较为明显的特征性CPE，光镜下观察可见部分细胞肿胀，变圆、折光性增强等特征：以MOI为lO和100感染MF和HF细胞时，MF细胞分别在第7d和第5d出现了明显的特征性C

8、PE，HF细胞分别在第5d和第3d出现了明显的特征性CPE，光镜下所见同前。5安徽医科大学硕士擘位论文随着时间的延长，细胞病变明显加重，颗粒状物越来越多，CPE扩展至整个单层细胞。MOI为0．1和1感染MF细胞后各时间点的培养物上清经PFU试验测定，均在第1和2d的取样中检测到病毒的滴度很低，其他5个时间点未检测到空