聚合酶链反应检测b细胞非霍奇金淋巴瘤免疫球蛋白重链基因重排的.研究

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1、结论：1、克隆性IgH重排可作为B细胞肿瘤与反应性增生鉴别的特异性标志，大部分情况下可作为系分化标志。2、在B-NHL患者形态学正常的骨髓和外周血中可检出克隆性Igft重排阳性细胞，二者检出率无显著性差异且与传统临床分期及A、B症状无关。3、临床缓解期骨髓或外周血克隆性IgH重排阳性预示可能近期复发，阴性者更可能持续缓解，个别IgH阳性者仍长期生存，其机理有待进一步研究。4、各种来源的标本，包括新鲜淋巴结、骨髓和外周血，经福尔马林固定、石蜡包埋的病理切片，存档的骨髓和外周血涂片，所提取的DNA均可用于克隆性IgH重排

2、的检测。5、检测石蜡包埋组织的克隆性IgH重排，半巢式PCR优于一步PCR：而骨髓和外周血用一步或二步PeR其结果无显著性差异。目IJ裔非霍奇金淋巴瘤(NHL)为起源于淋巴组织的恶性肿瘤，其组织学形态多样，常常给诊断带来困难。一个有经验的病理学家，结合完整的临床资料，仔细观察制作良好的组织切片，结合免疫组化，能确诊70％～80％的病例，其余20％～30％的病例通过形态学及免疫组化仍难以与反应性病变区别，如果以分子遗传学方法证实细胞增殖的单克隆性，则有利于肿瘤的诊断‘’8’。骨髓侵犯是NHL晚期及预后不良的一项指标。目

3、前有人应用形态学方法，以骨髓中幼稚淋巴细胞或淋巴瘤细胞大于5％作为BM受累的标准，若瘤细胞少于5％，诊断难以确定[9’10]。此外，大剂量放、化疗及造血干细胞移植治疗NHL已取得良好疗效，但复发仍是治疗失败的主要原因。已有证据表明，体内及移植物中残留的微量肿瘤细胞可导致复发，缩短生存期‘n-14i。因此，发展、建立一种能够检测体内微量肿瘤细胞的方法对NHL的分期、预后的判断等具有重要的临床意义。近年来国外用PcR和DNA杂交技术，可从105～106个正常细胞中检出1个t(14：18)阳性的肿瘤细胞[12-14]。此技

4、术已成为NHL的诊断与鉴别诊断、判断疗效及预后、预测复发的重要手段。但t(14；18)主要存在于滤泡型淋巴瘤(FL)，^亚洲地区FL发生率较西方低，bcl-2／IgH重排阳性率也不如西方国家高[15‘19J。而克隆性IgH重排几乎见于所有B-NHL，其中CDR3重排率最高，具克隆特异性[2叽21

5、。本研究采用半巢式PCR、PAGE及银染法，对石蜡包埋的淋巴瘤组织、新鲜骨髓及外周血、存档的骨髓及血涂片所提取的DNA进行克隆性IgHCDR3重排的检测，目的在于探讨这种基因标志对NHL的诊断、分期、细胞来源、判断疗效及预测

6、复发的价值。材料与方法一、病例来源和标本采集大部分病例来源于北京协和医院及中日友好医院的NHL患者，个别患者来自北京朝阳医院、第四人民医院和北京医院。病例总数49例，男29例，女20例，年龄17～77岁。48例经淋巴结等组织病理形态确诊，l例经骨髓及外周血细胞形态确诊。其中47例组织切片免疫组化CD20+(1例为CD45R+)或BM免疫分型证实为B细胞来源，l例免疫组化为非T非B-NHL，l例未作免疫组化。根据AnnArbor标准(1970)分期：IE3例、IIA2例、IIBl例、ⅢA9例、LItB3例、ⅣA10例、

7、IVB21例。分别于治疗前和／或临床完全缓解后和／或复发时采集骨髓3ml及外周血5～l0ml(部分标本为存档的骨髓或血涂片)，同时送涂片作形态学检查。共收集到38例诊断或复发时的福尔马林固定、石蜡包埋组织标本，其中37例证实为B-NHL，1例免疫组化示非T非B—NHL。对照：42例。男25例，女17例，年龄12～83岁。其中非肿瘤病人19例，肿瘤而非B细胞来源者23例。取骨髓、淋巴结或扁桃体组织，少数取外周血(详见表1)。二、仪器和设备GeneAmpPCRSystem2400夹芯式垂直电泳槽紫外分光光度计x光读片灯L

8、DZ5—2离心机t台式微量离心机微波炉小型三用水箱电子天平冰箱微量加样器三、试剂(一)提取DNA的试剂淋巴细胞分离液乙二胺四乙酸二钠氯化钠美国PE公司北京东方仪器厂日本岛津UV一1601北京市医疗设备厂北京医用离心机厂美国Brinkmann公司中国北京市医疗设备厂美国丹佛仪器公司中国法国GILSON中国医学科学院血液学研究所(Na：EDTA)北京化工厂十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白酶K无水乙醇三羟甲基氨基甲烷(Tris)无水醋酸钠TriS饱和酚氯仿二甲苯丙酮北京化工厂Sigma公司美国GIBCOBRL北京化工厂B．M公

9、司北京化工厂北京同正生物公司北京化工厂Sigma公司L六奠乱豇良t良吼加H(二)PCR所用试剂TaqDNA聚合酶10×PCR反应缓冲液dNTPs华美生物工程公司Promega公司引物北京赛百盛(美国)生物工程公司(三)DNA电泳所用试剂硼酸北京化工厂丙烯酰胺Sigma公司N，N’_亚甲双丙烯酰胺Fluka公司N，N，N’，N’，一甲基乙二胺(T