水稻广亲和基因s5-n遗传转化的分析及水稻osap蛋白家族的分析

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1、华中农业大学博士学位论文水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析姓名：陈炯炯申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张启发20081201华中农业大学2008届博士学位论文中文摘要水稻是重要的粮食作物之一，如何更加有效的提高水稻产量是全世界都关注的重要问题之一。水稻籼粳亚种间的杂种优势很早就被发现，但是籼、粳杂种Fl普遍存在不育或者半不育的现象，这使得籼粳亚种间杂种优势的利用受到了极大的限制。幸好，水稻资源中存在着一类特殊的种质资源，即广亲和品种。它能有效克服籼

2、、粳亚种不育或者半不育现象，给籼、粳杂种利用带来希望。本研究主要是分离克隆控制籼粳广亲和性状的一个主效基因舾基因，该基因位于水稻第6染色体上，编码一个天冬氨酸蛋白酶，通过控制籼粳杂种Fl代雌配子的育性而影响结实率。本研究在前人对髓位点定位工作基础上展开研究，鼬定位区段内主要包含三个候选基因为ORF3、ORF4和ORF5。对ORF3、ORF4和ORF5分别构建包含籼稻片段的正义转化载体，以粳稻Balilla为转化受体进行转化。通过对转基因植株小穗育性的考察，发现ORF3和ORF4的To代转基因阳性

3、植株和阴性植株的结实率不存在显著的差异，因此排除ORF3和ORF4作为候选基因的可能性。分析ORF5的To代转基因植株育性数据，发现转基因阳性植株的平均结实率2．8％，胚囊育性为12．8％，而阴性植株的平均结实率是53．3％，胚囊育性是76．7％，两者的花粉育性都在80％以上。以上结果表明，转基因阳性植株结实率下降的原因主要是胚囊败育，这表明ORF5可能是鼬基因。进一步分析ORF5的Tl代转基因植株育性数据，发现ORF5Tl(B10)代正义转化阳性植株平均胚囊育性为1．3％，阴性植株平均胚囊育性

4、为92．3％；阳性植株平均花粉育性为90．4％，阴性植株平均花粉育性为87．9％；阳性植株平均结实率为0，阴性植株平均结实率为89．4％，这一结果是完全共分离的，因此确定ORF5就是黔基因。为了分析鼬基因在广亲和品种中的功能，采用将正义转化载体ORF5．NJll转入受体广亲和品种02428后，得到的Tl代转基因阳性植株分别同籼稻南京ll和粳稻Balilla测交，考察测交后植株的结实率和胚囊育性，其中转基因阳性株系C04T1与粳稻Balilla进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是53．6％和5

5、3．5％，转基因阴性株系C04T1与粳稻Balilla进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是81．9％和72．8％；转基因阳性株系C04T1与籼稻南京ll进行测交后植株的胚囊育性ald,穗育性分别85％和67．5％，转基因阴性株系C04T1与籼稻南京ll进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是85％和4华中农业大学2008届博士学位论文63．5％。而另一株系C02T1测交后的胚囊育性类似于C04的结果。这一结果说明SS-n是没有功能的。通过原位杂交分析跖基因的表达情况，发现该基因主要在珠心细胞

6、、珠被、孢原细胞、大孢子母细胞中表达，在叶片、根等营养器官中没有表达。本研究还对鼬基因编码的天冬氨酸蛋白酶家族在水稻中的分布情况、进化关系、基因与蛋白的结构及天冬氨酸蛋白酶家族在水稻中在水稻中的表达情况进行了详细的分析。通过BLASTp搜索方法在TIGR、KOME、NCBIRefSeq数据库中进行搜索，最终确定水稻基因组中共有96个OsAP基因，它们分布在水稻12条染色体的不同位置。在进化上96个OsAP蛋白分可分为A、B和C三大类型，其中A类基因相比其他两类在进化上更加保守。而C类基因在数量上

7、最多，在基因结构上变异最大。根据CREP数据库中明恢63和珍汕97表达谱芯片数据，分析水稻中OsAP基因家族表达情况。通过聚类分析66个表达的OsAP基因，可以分为三类。第1类有分为4个亚类，10c和I丫亚类基因表达量都很低，Ip亚类的特点是在根中的表达相比其他组织表达要高，而16亚类主要是在开花前一天的雄蕊中高表达。第Ⅱ类包含26个基因，该类特点主要在营养组织表达量相对较高，而在幼穗组织中表达量相对较低；第1II类包含17个基因，该类特点是基因在大部分营养器官表达量比较低，但在幼穗发育时期的表

8、达量比较高。同时，本研究也对OsAP家族在光暗处理及激素处理情况下的差异表达基因也进行了分析，发现对珍汕97和明恢63发芽后48小时的胚芽及胚根进行连续光照处理48小时和连续暗处理48小时处理后共有14个2倍差异表达OsAP基因。在激素(NAA，GA3和I订)处理的条件下的表达情况相比3叶期的苗叶(seedling)，共有9个2倍差异表达OsAP基因。另外，比较分析12对位于大片段复制区的重复基因的表达模式，有7对在进化中出现新功能化，说明这个家族在进化中出现新功能化是在一个相对较高的水平。关键