atf3调控神经元凋亡机制

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1、中山大学博士后学位论文ATF3调控神经元凋亡的机制姓名：梅玉屏申请学位级别：博士后专业：药理学指导教师：黎明涛20080101ATF3调控神经元凋亡的机制5K：25K：DIV：刷K：ATF3：NGF：CGNs：RNAi：TNF：缩写词serum-freemediumcontaining5mMKCIserum-freemediumcontaining25mMKCIdaysinvitroC．JunNH2．terminalkinaseActivatingTranscriptionalFactor3nervegrowthfactor

2、cerebellargranuleneuronsRNAinterferencetumornecrosisfactorDMSO：dimethylsulfoxideMLK：EGFP：AD：PD：Bim：BME：MOI：mixedlineagekinaseenhancedgreenfluorescentprotein．Alzheimer’SDiseaseParkinson’SDiseaseBcl一2interactingmediatorofcelldeathBasalMediumEagleMultiplicityofinfecti

3、onATF3调控神经元凋亡的机制专业：药理学博士后：梅玉屏合作导师：黎明涛教授摘要由神经元凋亡而引起神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森氏病(Parkinson’SDisease，PD)和老年性痴呆症(Alzheimer’SDisease，AD)的主要病理特征。阐明对神经元凋亡起关键调控作用的分子及其信号转导机制，对揭示神经退行性疾病发生的本质，寻找、确立药物靶点，进一步达到有效防治神经退行性疾病的目的，具有至关重要的意义。大量研究表明，JNK／c—Jun通路的激活在神经元凋亡过程中发挥了重要作用。比如在撤钾处理小脑颗粒神经元

4、、撤NGF处理的交感神经元、D淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元或MPP+／MPTP诱导黑质神经元凋亡模型中，都己证明JNK被激活；激活的JNK通过磷酸化其下游底物转录因子c．Jun，促进靶基因的表达，从而诱发凋亡。研究发现：阻断JNK／c-Jun通路上的任何一点，如抑制JNK或其上游激酶MLKs，或直接抑制c-Jun转录活性均能有效地干预凋亡。说明JNK／c-Jun通路的活性为神经元凋亡所必需。然而，目前c．Jun促凋亡靶基因还有待进一步的研究。本实验室通过基因芯片技术筛选出一系列c．Jun候选靶基因并己报道Dp5是c-Jun的

5、靶基因且促进了神经元的凋亡。本论文主要是对其中一个较特殊的候选靶基因一ATF3进行深入研究。转录激活因子3(ActivatingTranscriptionFactor3，ATF3)是bZIP家族ATF／CREB亚家族的成员之一，能被多种诱导因子诱导的应激极早表达基因。ATF3含有典型的bZIP序列，依靠亮氨酸拉链结构形成二聚体发挥作用，当ATF3形成2ATF3调控神经元凋亡的机制同二聚体时会抑制基因的表达，其具体的作用位点是第40一84位氨基酸序列，此序列是发挥抑制作用的活性部位，因此含有与该位点结合的启动子能被ATF3抑制

6、；而当ATF3与ATF／CREB家族其他成员ATF2、c．Jun、JunB、或JunD等形成异二聚体时，依启动子和细胞状态发挥转录激活或抑制作用。所以，ATF3形成二聚体的形式决定了ATF3在细胞内发挥促凋亡还是抗凋亡作用，同时ATF3还能通过选择性剪接体ATF3Azip对靶基因的转录发挥间接调控作用。ATF3对细胞凋亡进程的调控起着很重要的作用。在非神经元细胞凋亡时，ATF3在促凋亡和抗凋亡两方面的作用都有报道。在神经元损伤时ATF3被诱导上调，并且被认为是神经元损伤的标记指标；也有通过过表达ATF3的方法报道了ATF3对

7、神经元具有保护作用。但是，作为一种由二聚体组成成分决定其调节功能的转录因子，过表达ATF3是不能揭示内源性的ATF3对神经元凋亡所起的作用。所以本研究利用RNA干扰技术，揭示内源性ATF3在撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用。同时，为了更进一步阐明过表达ATF3对神经元的保护作用，本文在过表达ATF3的基础上，探讨其发挥保护性干预神经元凋亡功能的可能机制。结果第一部分e-Jun靶基因ATF3促进小脑颗粒神经元凋亡1，撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，JNK／c-Jun通路激活及ATF3表达上调将小脑颗粒神经元体外培养6天后，分

8、别用25mMKCI(25K)或5mMKCI(5K)培养基处理O．5、l、2、4小时。收集蛋白后用磷酸化特异的JNK抗体检测JNK是否被激活。结果表明：JNK磷酸化水平在撤钾处理O．5小时就显著升高，并在后续的检测时间点持续增加，而JNK蛋白质总量保持一致，说明JNK被激活。为了进一步检测J