轮状病毒抗原免疫学检测方法与针对其三种主要抗原igg抗体的保护作用

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1、中国疾病预防控制中心病毒痫预防控制所硕士毕业论文摘要轮状病毒抗原免疫学检测方法及针对其三种主要抗原IgG抗体的保护作用硕士研究生：束弋导师：洪涛院士王健伟副研究员(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)摘要轮状病毒(rotavirus，RV)是全世界范围内人和动物急性胃肠炎的主要病原之一。RV由3层二十面体蛋白衣壳组成。其中，VP6蛋白是RV的组特异性抗原；VP7蛋白是RV的主要中和抗原，可诱导产生血清中和抗体；而病毒的非结构蛋白NSP4是第一个被发现的病毒性肠毒素，可能在其致泻机制中发挥重要作用。RV腹泻危害严重，缺乏特异的有效治疗药

2、物，疫苗已被证明是控制其危害的最好方法。虽然已经有很多证据表明，体液免疫在RV免疫保护中发挥重要作用，但其保护机制尚存在争论，尤其是究竟是IgA还是IgG以及针对哪种抗原的抗体发挥作用目前不清楚。对于轮状病病毒免疫机制的困惑，使得缺乏科学评价疫苗效力的可靠指标，也制约了更有效和更安全的疫苗的研发。鉴于此，本研究通过分别制备针对RVVP6、VP7和NSP4蛋白的IgG抗体，被动免疫小鼠后，观察这些IgG抗体的保护作用，从而为进一步阐明轮状病毒的免疫保护机制、发现疫苗效力可靠评价指标提供线索。另外，RV的预防控制将是公共卫生工作的长期任务，

3、这一工作的开展离不开快速、准确的RV实验室诊断技术。本研究利用单克隆抗体技术制备了针对RVVP6蛋白的单克隆抗体(McAb)，并在此基础上建立了RV检测用双抗体夹心ELISA方法。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所硕士毕业论文摘要1抗轮状病毒VP6单克隆抗体的制备及轮状病毒双抗体夹心ELISA方法的建立为了建立一种快速、有效地制备单克隆抗体的方法，本研究使用表达轮状病毒VP6的重组腺病毒rvAdVP6(opt)作为免疫原，经鼻腔免疫BALB／c小鼠3次、经脾内注射加强免疫一次后，取得了良好的免疫效果，小鼠血清抗体滴度在8w内达到(2．

4、钍O．43)x105。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0融合之后，成功筛选到分泌高滴度特异性单克隆抗体的2个杂交瘤细胞克隆1-5A7和4-3E3。经ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和WesternBlot等验证，这两株McAb均特异性识别RVVP6三聚体形式的构象依赖性表位，但识别的抗原表位不同。在此基础上，以1．5A7作为捕获抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的4-3E3为检测抗体，建立了基于抗VP6单克隆抗体的检测轮状病毒的夹心ELISA方法。应用本方法对临床婴幼儿无菌性腹泻标本样品中的RV进行了测定，测定结果与传统RT-PC

5、R方法进行了比较，二者在统计学上不存在差异(f=1．55，p>O．05)。以轮状病毒的RT-PCR检测方法为标准，检测双抗体夹心ELISA的特异度和灵敏度分别为73．3％和95．8％，二者的符合度为87．1％。本研究获得的McAb不仅可用于轮状病毒的常规ELISA检测，也为未来腹泻病毒病原高通量检测的蛋白芯片等技术开发打下了基础。2抗轮状病毒VP6、vP7和NSP4lgG抗体对小鼠免疫保护作用的研究为了制备抗RVNSP4的IgG抗体，首先分别在腺病毒和杆状病毒载体中对NSP4进行了表达。为了提高NSP4的表达量，在不改变氨基酸序列的前提

6、下，根据人类细胞的密码子偏性，人工优化合成了RV的全长NSP4基因。分别将密码子优化过的和野生型NSP4基因插入腺病毒载体系统的穿梭质粒pp2和秆状病毒表达载体pFastBacl，通过细菌内同源重组和细胞转染得到了表达野生型NSP4基因的重组腺病毒rvAdNSP4(ori)和表达野生型与密码子优化NSP4基因的重组杆状病毒rvBacNSP4(ori)和rvBacNSP4(opt)。Westernblot试验证实这些重组病毒可有效表达NSP4基因。在此基础上，分别使用表达RVVP6、G3型vP7和NSP4蛋白的重组腺病毒rvAdVP6(o

7、pt)、rvAdG3VP7(opt)和rvAdNSP4(ori)经．鼻腔免疫雌性BALB／c小鼠4次，收获血清后利用ProteinG柱亲和纯化血清中的IgG抗体。分别将纯化的IgG抗体按高(VP6抗体滴度30000，VP7抗体滴度16000)、低(VP6抗体滴度3000，VP7抗体滴度8000，NSP4抗体滴度2000)两种剂量经尾静脉注射4中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所硕士毕业论文摘要被动免疫BALB／c小鼠。被动免疫1d后高剂量组的VP6抗体和G3VP7抗体在血清中的滴度分别达到了4000a：0．00和2400士-894．43

8、，低剂量组的VP6抗体和G3VP7抗体分别达到了1100士547．72和180a：44．72，而NSP4低剂量组的小鼠体内只检测到<25的抗体滴度，实验组粪便样本中未检测到黏膜局部IgG抗体和IgA抗体的升