hbv感染不同状态下树突状细胞生物学的的研究论文

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1、摘要目的树突状细胞(dendriticcells，DCs)是一种最具潜能的抗原提呈细胞，其对抗原进行捕获、加工，处理后提呈给组织相容性复合物(majorhistocompabilitycomplex，MHC)．I、II类分子，诱导T淋巴细胞的增殖，在增强或调节细胞介导的免疫反应中起着决定性作用。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染者DCs的相关研究目前愈来愈受到众多学者的关注。本课题拟研究慢性乙型肝炎不同感染阶段外周血来源DCs的功能特点，比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异，并研究CpG0DN能否促进DCs成熟，增强DCs功能，

2、从而进一步揭示HBV感染不同状态下DCs的免疫功能。方法本研究对10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV携带者及lO例健康对照者外周血来源DCs进行体外培养，应用流式细胞技术检测DCs的表面分子HLA．DR、CD80、CD86的表达，ELISA检测DCs培养上清IL．12水平，以比较DCs在慢性乙型肝炎不同感染阶段的功能特点；同时运用荧光定量PCR的方法，对12例慢性乙型肝炎血清HBV。DNA阳性患者及10例血清HBV—DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV．DNA进行了检测，并比较DCs中HBV不同滴度时DCs的功能差异；通过予以含非甲基化CpG基序的寡脱氧核

3、苷酸链(unmethylatedCpGmotifcontainingoligodeoxynucleotides，CpGODN)干预，研究CpGODN能否有效促进DCs成熟，增强DCs功能。厶七甲"171木(1)实验结果显示，体外用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI．1640完全培养基(iJHGM．CSF矛NIL一4)诱导人的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)来培养DCs，24小时后可见贴壁单核细胞聚集成大小不等葡萄串状，粘附于培养板底，第3天可见这部分细胞体积增大，第4天可见部分细胞悬浮于细胞培养液

4、，第5天可见这部分细胞数目增多，部分细胞出现许多毛刺。第7天培养液中飘浮着大量有明显树突状的大个细胞或细胞团。将培养7天的DCs收集在透射电镜下观察，每个视野充满DCs，可见细胞体积较大，细胞表面突起比较丰富，胞浆内粗面内质网丰富，线粒体结构较清楚，溶酶体丰富，核大而圆，核膜清晰，染色质分布较均匀。慢性乙型肝炎患者及HBV携带者HLA．DR、CD80和CD86的表达率较正常对照组普遍降低，但HLA．DR、CD80和CD86的表达水平在慢性乙型肝炎患者及HBV携带者之间的差异无统计学意义。ELISA检测培养第7天DCs上清IL．12水平，发现在DCs培养上清液中

5、，IL．12的表达水平在慢性乙型肝炎患者及携带者明显低于正常人，而慢性乙型肝炎患者与携带者之间则无明显差异。(2)对12例慢性乙型肝炎血清HBV—DNA阳性患者及10例血清HBV．DNA阴性患者外周血来源DCs内的HBV．DNA进行检测发现：12例血清HBV—DNA阳性患者，其中有7例其DCs内可检测到HBV．DNA，5例DCs内未检出HBV．DNA，DCs内HBV．DNA检出率为58．3％。流式细胞仪分析显示，正常人的皿A．DR、CD80和CD86的表达阳性率均在58％以上，而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA阳性组及血清HBV-DNA阴性组HLA—DR、CD8

6、0和CD86的表达率较正常人组普遍降低，尤以血清HBV-DNA阳性组下降更为明显。7例DCsHBV-DNA阳性组及15例DCsHBV-DNA阴性组甩A．DR、CD80和CD86的表达率亦较正常II人组普遍降低，尤以DCsHBV-DNA阳性组下降更为明显。DCs培养上清IL．12水平在血清HBV-DNA阳性组明显低于血清HBV-DNA阴性组及正常人组，血清HBV-DNA阳性组又低于血清HBV-DNA阴性组。而IL．12的表达水平在DCsHBV-DNA阳性组明显低于DCsHBV-DNA阴性组及正常人组，DCsHBV-DNA阴性组又低于正常人组。相关分析显示，DCs

7、表面分子的表达及DCs分泌IL一12水平与血清及DCsHBV载量均呈显著负相关。(3)将培养第6天的DCs，加入CpGODN继续培养24d,时后，透射电镜观察CpGODN刺激后DCs与完全培养基对照组DCs相比，其表面的突起丰富、增粗，粗面内质网增多，空泡减少甚至消失。用流式细胞仪分析显示，CpGODN束U激组CD80、CD86及HLA．DR的表达阳性率在慢性乙型肝炎组、HBV携带者组及正常人组均完全培养基对照组明显升高。完全培养基对照组甩A．DR、CD86、CD80的表达阳性率在慢性乙型肝炎组、携带者组及正常人组之间比较发现：慢性乙型肝炎组及携带者组HLA．

8、DR、CD86、CD80的表达阳性率较