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《基于位点特异性pcr黄芪和红芪鉴别方法探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、基于位点特异性PCR黄茂和红英鉴别方法探［摘要］研究黄茯与红茂药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄茂药材30份、红英28份，所有样品进行总DNA的提取，通过对黄茂及红茂药材trnL-trnF片段进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增，发现黄英可扩增出136bp片段，红茂可以扩增出323bp片段。黄英中掺入10%以上红英可以扩增出红英特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄英与红英药材
2、的快速、准确鉴别。［关键词］黄竄；位点特异性PCR；分子鉴定［收稿日期］2013-03-07［基金项目］国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BA128B02)；中医药行业科研专项(201107009)；包头科技发展项目(2011X1002)［通信作者］*李旻辉，博士，教授，主要从事蒙药分子鉴定与资源保护研究，Tel:(010)64014411-2956,E-mai1:li_minhui@yahoo.cn；*周立社，教授，主要从事分子生物学研究，Tel:13604726512,E-mail:zhouli
3、she@sohu.com临床常用中药黄茯，是豆科植物蒙古黄英Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsia.o或膜荚黄英A.membranaceus(Fisch.)Bge的干燥根［1］。始载于《神农本草经》，传统中医药理论认为黄英，性味甘、微温，具有补气固表、利水生津、托毒排脓、生肌等功效［1］。现代医学研究表明黄茂有强心、利尿、降压、抗菌、提高机体免疫功能和促进新陈代谢等作用［2-3］o由于近几年黄英有效成分的深入研究,作为药食两用
4、的黄英资源得到了广泛的开发和利用，使得市场对黄英资源的需求急剧增加。市场上除了正品黄英外，尚有代用品、伪品和混淆品。而在中医临床用药中，黄英和红茂通常混用并相互替代，其中红英是豆科植物多序岩黄英HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，其根茎在外形上与黄茯极为相近，但是质量差异较大。因此，建立一种用于快速、准确鉴别黄英药材的方法对于保障人民用药安全意义重大。黄英药材鉴别的方法较多，鉴定手段也从原植物鉴别、性状鉴别、显微鉴定发展到应用色谱、光谱技术［4-6］o而对于黄竄与红竄的鉴
5、别方法，有显微和色谱的方法曾被报道过［4,7］。目前市面上销售的黄英多为加工过的药材，而加工过的红英药材或其伪品的表面性状、显微特征等与黄英药材都较为相似［4-5,8］,在实际运用中要进行准确鉴别存在一定难度。同时应用形态学和组织学等方法来鉴定黄英存在主观性较大、特异性不强、通用性差、对观察者经验的要求高等缺陷，不利于规范化、标准化方法的建立及普及。而DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，近几年分子生物学中该技术的研究则为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。对于黄茂分子鉴别方面，张曦
6、等对中药材黄茂进行了DNA指纹图谱鉴别研究[9],而前期课题组已经通过ITS序列差异分析对黄茂及其红茂等混伪品的遗传关系作初步的研究[10],为了寻找更快速、准确、稳定的分子鉴别方法，对位点特异性PCR方法进行了研究。目前位点特异性PCR方法已成功用于中药材鉴定等方面的研究，如金银花、人参、陈皮等中药材的真伪鉴别[11-13],因此本研究通过位点特异性PCR方法对黄茂及其混伪品红英进行研究，为准确进行黄英与其混伪品的鉴别提供科学的客观依据。1材料2XCTAB提取液，1XTAE缓冲液，琼脂糖（Promega
7、公司），澳化乙锭（Fluka公司），DNATaq聚合酶（Takara公司），2000bpDNAMarkar（Takara公司），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。PCR仪（德国Eppendorf,型号5332）,电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12）,低温冷冻离心机（德国Eppendorf,型号5810R）,紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene,型号GBOXHR）,混合型球磨仪（德国Retsch,型号MM400）,数控超声波清洗器（型号KQ-500DE）,微量移液器（德国Eppendor
8、f）o本实验选取58份材料包括采自内蒙古的黄茂18份；采自山西的黄茂5份；采自甘肃的黄茂5份；红英28份，分别采自内蒙古和甘肃；以及2批购自市场上的黄茂药材。凭证标本保存于内蒙古科技大学包头医学院。名称、采集地点、序列号见表lo表1材料信息Table1ThesourcesofAstragaliRadixandHedysarumRadix2方法2.1鉴别引物的设计选择通用引物trnL-trnF对黄英和红英样品进行扩增[14],然
