hiv病毒分子生物学检测技术进展

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1、HIV病毒分子生物学检测技术最新进展【摘要】随着艾滋病感染患者的增多，为适应艾滋病大规模筛查和尽量早期诊断治疗的需要，目前艾滋病检测技术向着简易、快速、可靠的方法的方向发展，HIV核酸检测的灵敏度和特异性显著提高，缩短检出HIV的窗口期，在艾滋病早期诊断和治疗以及艾滋病的预防方面发挥着重要作用，是HIV实验室诊断发展的主要方向。本文对HIV核酸检测的各种技术原理、特异性、可靠性及临床实用性的前沿研究进展进行综述。【关键词】HIV病毒；分子生物学检测；进展艾滋病病毒(HIV)主要侵袭人体免疫系统，导致人体免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。

2、艾滋病的不可治愈及其快速传播使患者不断增多,2012年全球感染总人数已达3900万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发现，为了防止艾滋病的大规模流行，艾滋病的检测工作越发重要。目前筛查的免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的传播蔓延有重要意义。1HIV生物学特性HIV呈圆形或椭圆形，直径900〜140nm,外层为类脂包膜，成分是外膜糖蛋白(gpl20)和跨膜糖蛋白(g

3、p41),核心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构一一基因长末端重复序列(LTR)、核心蛋白(gag),聚合蛋白(pol)、包膜蛋白(env)gF,还有非常复杂的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、vpr.vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV基因组中存在3个gag-pol-env.Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的外围，由主要的P2

4、4和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gpl20和gp41,起协助HIV进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31,它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关［1］。根据env基因V3段碱基排列的不同，HIVT分为11个亚型即A、B.C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亚型，HIV-2分为6个亚型［2］,不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上有着重要意义。2HIV-1的感染机制及感染标志病毒侵入人体后，通过病毒表面g

5、p!20在化学因子CCR5或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41的协助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-,在DNA多聚酶的作用下复制DNA,此DNA部分存留在胞浆内产生系列变化，然后在细胞膜上装配成新病毒，再感染其它细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA,其次是p24抗原，最后是抗体［3］。3分子生物学检测技术随着分子生物学检测技术快速发展，HIVRNA或DNA检测得到应用，核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方向［4］,在HI

6、V感染的监测、诊断、研究、疗效观察及预后判断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两类。3.2定性检测3.2.1原位杂交（insitehydzmion）应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合酶链反应（PCR）略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛使用，基因探针技术也就逐渐失去应用意义。3.2.2聚合酶链反应技术（PCR）PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖

7、于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成。患者感染HIV1〜14d后血浆中能检测出HIVRNA,可用于急性感染期患者、抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的诊断中有着非常重要的意义，前病毒DNAPCR检测法对出生48h内的婴儿检测敏感性为38%,出生14d的婴儿检测敏感性达93%[5]o3.2.3逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现，即将病毒RNA逆转录DNA,接着进行PCR,指数扩增DNA片段，

8、将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR技术可在2h内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，准确定量的RT-PCR方法已被许多商业实验室证实,目前多种改良的快速RT-PCR检测方法应用于H