根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得

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1、根癌农杆菌介导水稻成熟胚及抗褐飞虱基因植株的获得　　摘要：以水稻（OryzasativaL.）籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚为材料，以携带有双元载体的根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105为载体进行抗飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遗传转化，共获得515棵再生植株，包括198株Bph14转基因植株、72株Bphi008A转基因植株和245株Osz！转基因植株。PCR检测结果表明，获得的515株再生植株中，有244株阳性转基因植株，3个不同抗褐飞虱基因中，转Bvh14基因的

2、再生苗阳性率最高，增加筛选次数能有效减少转化所得的假阳性植株。　　关键词：水稻（OryzasativaL.）；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导转化；抗褐飞虱基因　　中图分类号：S511文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）09-2392-04　　近年来，褐飞虱迁入中国的虫量大，由于目前大多数水稻（OrvzasativaL.）品种不抗虫，尤其是一些主要的杂交稻品种，对褐飞虱等虫害还有“超感虫性”7（hyper-susceptibility）。目前，水稻褐飞虱已经成为一种爆发力强、对水稻危害性极大的

3、虫害。由于褐飞虱的危害多发生在水稻成熟灌浆期，此时若大量使用杀虫剂，对水稻的污染会非常严重，这也是中国水稻生产中迫切需要解决的重要问题。研究证明，利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中经济有效的方法。通过转基因技术与常规育种技术相结合培育抗褐飞虱水稻品种，有效控制褐飞虱的发生与危害，可确保中国水稻生产持续稳定发展和国家粮食安全。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导的转化系统是对天然载体转化系统的一种模仿，已在水稻转基因育种及功能基因组研究中被广泛应用，1994年以后，由于技术上的突破。相继在不同水稻品种

4、中获得成功，转化效率也大大提高，如粳稻的转化率一般在30%左右，最高可达到64.6%。本研究以育种上应用的典型籼型两系恢复系M5274和晚粳稻不育系N55S为材料，利用根癌农杆菌介导法对褐飞虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl进行遗传转化，目的是通过3个抗褐飞虱基因的导入，探索水稻抗褐飞虱育种的新途径，以期提高其产量和品质。　　1材料与方法　　1.1植物受体材料　　两系恢复系M5274、晚粳稻不育系N55S，由湖北省农业科学院粮食作物研究所选育。　　1.2农杆菌菌株与质粒载体　　根癌农杆菌菌株EHA105，质粒PCAMBIA1300

5、的T-DNA区含有潮霉素抗性基因（Hygr），抗褐飞虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武汉大学提供。　　1.3材料的处理及接种7　　选取健康饱满无病斑的成熟种子，除去颖壳，用75%乙醇浸泡1min，然后将种子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中，搅拌10-12min。灭菌后用无菌水冲洗4-5次，最后将种子取出置于无菌滤纸上，待种子表面干燥后，以平摆法将其接种于各自不同的诱导培养基上，每瓶12-14粒。每个品种接30瓶。　　1.4水稻组织培养　　粳稻组织培养培养基见表1，籼稻组织培养基为LY培养基，购自武汉博远生物科技有限公司。将成熟胚表

6、面按“1.3”的方法消毒后接种于愈伤组织的诱导培养基上。　　1.5农杆菌的培养及其介导的水稻转化　　根癌农杆菌的培养及其介导的转化过程参照Hiei等的方法。　　1）划菌：取转化后经检测有所需载体的农杆菌保存菌液5-10μL，至YEB（加入浓度为100mg/L的卡那霉素）的固体培养基上涂板，30℃黑暗培养，直到长出单菌落。将单菌落二次划线培养农杆菌24-36h，刮菌体于悬菌培养基中，30℃180r/min摇菌3-4h，调整菌液OD600nm至所需值。　　2）侵染：用悬浮培养基稀释菌液，直到OD600nm为0.1-0.9，将含农杆菌菌液倒入已放好愈

7、伤的培养瓶中，根据菌液浓度在30℃摇床上侵染5-30min。倒掉菌液，用灭菌的滤纸将菌液吸干，用镊子把愈伤组织转移到共培养培养基上，20℃黑暗培养48-72h。　　3）洗菌：把共培养基上的愈伤组织转入灭菌三角瓶中，用无菌水清洗5-6次，直到水不再浑浊。然后加入灭菌水（含有500mg/L头孢霉素）120r/min28℃摇菌15-20min。　　4）晾干愈伤：把水倒掉，把愈伤组织转移到放有灭菌滤纸的培养皿中，在超净台吹40-50min。7　　5）把晾干的愈伤组织转移到筛选培养基上进行筛选培养，分别进行一轮和两轮筛选培养。每轮25d左右，比较筛选的有

8、效性。　　6）把筛选出的抗性愈伤组织进行预分化、分化和生根培养。　　1.6转基因水稻植株的PCR鉴定　　1.6.1转基因植株总DNA的提取按CTAB法