芝麻饼残油降解菌的选育诱变

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1、芝麻饼残油降解菌的选育诱变　　摘要：从自然界土壤中采集到一株可降解芝麻饼残油的菌种，经16SrDNA测定其序列后通过GenBank进行比对及聚类分析。结果表明，菌株16SrDNA长度为1496bp，聚类分析显示与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的同源性达99%以上，该原始菌株经过以Co60为惟一放射源的辐射诱变，获得突变菌，编号为MT-26。经测定，MT-26的酶活力可达725U/mL，并对其进行传代试验，证明其具有良好的遗传稳定性。　　关键词：残油降解；放射诱变；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）　　中图分类号：Q939.9文献标

2、识码：A文章编号：0439-8114（2016）16-4138-03　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.0166　　芝麻属脂麻科，在中国是一种常见的经济作物，是香油类生产的原料。由于香油的品相要求，芝麻在取油工艺上通常使用传统的压榨法取油，以保留香油最纯正的味道[1]，然而通过传统压榨法取油后的芝麻饼中往往含有相当可观的残油量[2]。研究表明，芝麻油中的芝麻素是含量最高的木脂素[3]，由降解芝麻油而获得的小分子脂类物质对调节动植物的生理代谢有比较显著的作用[4，5]。本研究试图对芝麻压榨提油后剩余的饼粕中残油加

3、以利用，对其进行降解获得有应用前景的小分子脂类，提高芝麻饼粕的附加值。笔者在自然界中广泛筛选可有效降解芝麻饼残油的菌株，并对其进行诱变和条件优化，为芝麻饼残油降解菌在农业生产中的应用提供理论支持。　　1材料与方法　　1.1材料　　土壤样品于2013年2月20日采集于湖南长沙市芙蓉区东风屠宰厂，将采集土壤压碎，去除石块、植物根茎，混合均匀，装入聚乙烯自封袋中，于泡沫冰盒中运输及保存[5]。　　初筛培养基：芝麻饼50g/L，121℃灭菌25min。显色培养基：芝麻油20g/L，FeSO40.1g/L，葡萄糖10g/L，（NH4）2SO40.1g/L，MgSO40.1

4、g/L，NaCl1g/L，溴甲酚紫0.02g/L（1.6%溶液），pH自然。LB培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L。　　1.2方法　　1.2.1菌株的筛选1）菌株的初筛及分离纯化：称取适量处理后的土壤，加入90mL培养基中进行摇瓶处理，置于37℃恒温摇床中24h[6]。发酵液摇匀后取1mL，加9mL灭菌水稀释至10-2，后依次稀释至10-6作不同的浓度梯度，并取200μL加入制备好的LB培养基中涂布均匀，置于37℃培养箱中倒置培养，将培养出的细菌用画线法挑选形态不同的菌斑且较大的菌株进行纯化[7]。　　2）产脂肪酶菌株的确

5、认：由于脂肪酶降解脂肪后的主要产物为小分子脂肪酸（普通小分子脂肪酸pH为4.8～5.3），本试验使用溴甲基紫作为培养基显色剂，判断菌株是否产生脂肪酶。将纯化好的不同形态菌落接入筛选培养基，如在含溴甲酚紫的培养基中出现淡黄色显色圈，而未接种的培养基内溴甲酚紫不变色，即可初步判定该菌株具有产脂肪酶能力[8]。6　　1.2.2酶活力及生物量的测定脂肪酶活力测定采用对硝基苯法[9]，酶活为40℃下每分钟分解释放出1μmol对硝基苯酚的酶量，定义为一个活力单位（U）。生物量测定使用平板计数法。　　1.2.3菌株的鉴定挑取单菌落接于1mL无菌水中，置于100℃沸水浴10mi

6、n，5000r/min离心10min，取上清液2μL作为PCR模板，16SrDNA引物5′-AGGCAGCAGTAGGGAATCTT-3′，5′-CGTGGCTTTC　　TGGTTAGGT-3′扩增产物交由华大基因公司进行测序。将获得的序列提交GenBank进行比对，提取相似度最高的前5条序列使用MEGA5.05进行分析。　　1.2.4菌株的诱变将初筛具有较高酶活的菌株置于含溴甲酚紫的显色LB培养基中，送湖南省辐射中心进行放射量为60Gy的Co60放射诱变，将相同接种量的培养基用1cm厚的均质铅板隔绝直接放射后进行不同时间梯度的诱变。　　1.2.5发酵效果的测定

7、使用索式抽提法测定芝麻饼发酵前后的粗脂肪含量以测定发酵效果[10]。　　2结果与分析　　2.1菌株初筛结果　　对试验初筛获得的128株有显色圈的菌株（图1），经精确测定菌落半径与显色圈半径的比值后，挑选出30株菌株进行酶活力与生物量的测定，结果见表1。由表1可以看出，菌株酶活为68.203～264.321U/mL，生物量为12×107～98×107个/mL，进行测定后选择8号菌株，并命名为MT菌进行下一阶段试验。6　　2.2菌株的诱变　　运用Co60对出发菌株进行放射诱变处理，由图2可知，诱变4h的菌株致死率达到80%，处理5h致死率达到96%，为提高处理量和诱

8、变效率，试验选择5h作为