基于石英毛细管载体的血清甲胎蛋白灰度分析免疫检测法

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1、基于石英毛细管载体的血清甲胎蛋白灰度分析免疫检测法　　摘要以熔融石英毛细管为免疫分析载体材料，以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白，将AFP捕获抗体固定于毛细管，AFP和AFP的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体分别注入毛细管进行孵育，形成双抗体夹心结构。注入化学发光底物液后，HRP催化底物液发光，产生的光信号通过成像仪转化为图片。对图片进行灰度值分析，建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析检测法。当捕获抗体稀释倍数为100，酶标抗体稀释倍数为200，化学发光曝光时间为20s时，本方法可在3.1～50ng/mL浓度范围

2、实现甲胎蛋白测定，检出限为2.7ng/mL。对20例人血清临床实际样本进行检测，结果令人满意，加标回收率在96.0%～106.7%之间。本方法样本消耗少、材料简单、检测成本低、不依赖大型仪器、适用性广，具有较好的临床检验应用前景。　　关键词石英毛细管；甲胎蛋白；免疫分析；灰度分析　　1引言　　随着我国医疗卫生事业的快速发展和人们对健康保健的日益重视，社会对实用性的检测技术需求越来越多，体外诊断的新方法、新技术已成为生物分析检测的热点和重点研发方向。目前，低成本、操作简便、小型化的体外诊断方法和装备的研究正受到科研机

3、构和医疗检测市场的广泛关注。12　　现有的体外诊断产品中，免疫检测类产品占比很大，主要采用酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光法、放射免疫法以及胶体金免疫层析法[1～3]。前两者以微孔板为检测载体，技术较成熟，但检测时间较长，一般需要2～3h；电化学发光法主要基于磁珠捕获抗原进行检测，检测速度快，一般可在30min内完成，但检测成本较高，约为酶联免疫吸附法的3～4倍；放射性免疫检测灵敏度高，但对操作环境及操作人员要求很高；胶体金免疫层析检测速度快，可实现现场检测，但难以实现定量分析。近年来，一些学者报道了基于纳米

4、材料及微流控技术的新型体外免疫诊断方法，但纳米材料的制备较难控制其稳定性，真正实现临床应用的并不多见[4，5]。本课题组多年从事毛细管电泳生物医药分析研究，所用的分离载体是熔融石英毛细管，其性质稳定，透光性好，表面易进行物理、化学修饰，加工工艺成熟，成本低廉[6～10]。本实验将熔融石英毛细管用于免疫检测的载体材料，研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫检测方法，目的是实现基于石英毛细管材料和灰度分析的定量免疫检测。传统的化学发光免疫分析检测器大多采用光电倍增管，检测区域有限，分析速度慢，而以电感耦合器件（CCD

5、）为代表的图像传感器则可以提供更加广泛的检测区域，具有光电转换效率高、动态线性范围宽、多通道同时分析等优点，成为未来生物传感器的一个发展方向[11，12]。实验中使用的便携式化学发光成像仪采用制冷CCD，灵敏度高，体积小，仅有0.006m3，能够高效捕获化学发光信号，形成图片。灰度是指黑白图像中点的颜色深度，灰度分析法具有结果直观，分析快速等优点，在生物学、医学、图像识别领域有广泛的用途[13]，12很多体外诊断试剂的检测应用也采用灰度值分析方法[14]。　　本研究以熔融石英毛细管为载体，建立了基于灰度分析的免疫检

6、测方法。以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白，通过双抗体夹心方式进行检测，与抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光底物液发光，产生的光信号通过成像仪转化为图片[12，15，16]，进行灰度值分析。研究结果表明，毛细管免疫检测和灰度分析结合，实际使用的样本量仅为0.8μL，而ELISA检测一般需要50μL，因此本方法大幅降低了样本使用量。检测过程中仅需石英毛细管、医用注射器等常用耗材，操作简单，不依赖大型仪器。所建方法具有普适性，可用于基于化学发光免疫分析的生物标志物的快速检测。　　2实验部分　　2.1仪

7、器与试剂：　　便携式化学发光成像仪（国家纳米科学中心研制）；熔融石英毛细管（北京华阳利民仪器有限公司）；医用注射器（北京科龙生物医学技术有限公司）；表面活化剂（美国AnteoTechnologies公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德国Merck公司）；AFP捕获抗体、AFP的HRP酶标抗体及AFP标准液（北京科跃中楷生物技术有限公司）；癌胚抗原（CEA）标准液、前列腺特异性抗原（PSA）标准液、糖类抗原125（CA125）标准液及糖类抗原199（CA199）标准液（北京沫之东生物技术有限公

8、司）；化学发光底物液（美国Millipore公司）；实验用水由Millipore纯水仪制备。　　2.2分析方法12　　2.2.1实验操作步骤实验步骤如图1所示：（1）活化毛细管将毛细管裁剪为10cm长，使用医用注射器将表面活化剂注入毛细管，室温静置30min，对毛细管内壁进行活化后，用水冲洗。（2）固定捕获抗体及封闭将AFP的捕获抗体按照一定比例用PBS稀释