竹节参总提物对h2o2诱导sh-sy5y神经细胞损伤的保护作用

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1、竹节参总提物对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用杨莉，袁丁，代艳文，狄国杰，张长城，刘朝奇，王婷（443002湖北宜昌，三峡大学医学院）[摘要]目的观察竹节参总提物对过氧化氢(H2O2)诱导的SH-SY5Y人神经瘤母瘤细胞损伤的保护作用。方法细胞分为正常对照组，H2O2（600µmoL/L）处理组和H2O2+竹节参总提物(0.1、1、5、20µg/mL）预处理组。体外培养SH-SY5Y细胞，加入竹节参总提物孵育12h，再加入H2O2作用12h建立氧化损伤模型。显微镜观察细胞形态，应用MTT检测细胞活力，酶生化法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二

2、醛（MDA）含量，DCFA-DA探针检测细胞内活性氧（ROS），流式细胞术检测细胞凋亡率。结果与H2O2组比较，竹节参总提物各剂量组较H2O2组的细胞存活率上升，分别上升了14.4%、29.88%、32.48%、38.98%（P<0.05）；LDH释放量下降，其中5、20µg/mL分别下降了60.19%和57.71%(P<0.05)；SOD活力显著升高，竹节参总提物1、5、20µg/mL较模型组上升了66.25%、56.37%和80.94%（P<0.05）；MDA含量显著降低，竹节参总提物1、5、20µg/mL较模型组下降了51.52%、86.28%和87.54%（P<0.01）；ROS荧

3、光强度及细胞凋亡率也显著降低。结论竹节参总提物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用，其机制可能是通过增强细胞的抗氧化能力从而减轻H2O2诱导的细胞凋亡。[关键词]竹节参总提物；H2O2；氧化应激；凋亡[中图法分类号][文献标志码]A[基金项目]国家自然科学基金（81100957）；湖北省自然科学基金（2010CDB10703）；三峡大学博士启动基金（KJ2009B077）[通信作者]王婷，电话：（0717）6397466，E-mail:tingting0301@126.com神经退行性疾病是一类严重危害人类健康的常见病。氧化应激在神经退行性疾病的发病中发挥着重要作用[1]。氧

4、化应激是在机体受到有害刺激时，体内的自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统与抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤引发一系列疾病[2]。竹节参是我国常见的中草药，据2010版中国药典记载，竹节参具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮的功效。有研究表明竹节参总提物（PanaxJaponicusextract,PJE）具有较好的抗氧化活性[3]及清除自由基的功效[4-5]。但竹节参总提物对神经细胞氧化应激损伤的保护作用鲜有报道，基于此本文采用体外培养SH-SY5Y细胞，给予竹节参总提物后用H2O2刺激，观察竹节参总提物的保护作用，为抗神经退行性疾病药物的研发提供理论基础。1材料与方法

5、1.1材料人神经瘤母瘤细胞（SH-SY5Y）由华中科技大学同济医学院惠赠。细胞以含10%胎牛血清DMEM完全培养基培养于37℃，5%CO2培养箱中。竹节参总提物：取竹节参干燥根茎粗粉，加入60%乙醇加热回流3次，合并滤液后浓缩干燥，得到竹节参总提物粉末，得率为25.8%。双氧水（H2O2，北京化工厂生产）；DMEM培养基（Gibico公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Gibico公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司）；活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；AnnexinⅤ/PI试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MD

6、A）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。荧光倒置显微镜（NIKONTP1020）；NU-4750E型CO2培养箱；DMR型多功能显微镜及图像分析系统；SW-4T-2F洁净工作台；KQ-500B超声波清洗器。1.2方法1.2.1实验分组取对数生长期的细胞接种于孔板中，于5%CO2，37℃培养箱中培养24h，分别加入不同浓度（0.1、1、5、20µg/mL）的竹节参总提物培养12h，再加入H2O2（600µmoL/L）继续培养12h。模型组直接加入600µmoL/LH2O2处理12h。(以下实验细胞处理方法相同)1.2.2MTT法检测细胞活力收集细胞，制成5×104/mL细胞悬液，取96孔酶标板

7、，每孔加入200µL细胞悬液，处理后各孔同时加入20µLMTT（5g/L），37℃孵育4h，弃上清，每孔加入150µLDMSO，混匀后于酶标仪上570nm测定光密度值。1.2.3SH-SY5Y细胞的形态学变化倒置显微镜观察正常对照组、H2O2组、竹节参总提物各剂量组保护后的细胞形态。1.2.4酶生化法检测LDH释放量、SOD活力和MDA含量收集细胞上清，参照LDH试剂盒检测细胞上清LDH的活性。裂解细胞，参照SOD、MD