浙大生化实验二

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1、用沪必学实验报告专业：生物科学姓名：学号：F1期：-地点：课程名称：生物化学实验（甲）指导老师:成绩：实验名称：蔗糖酶蛋白含量测左及活力测定实验类型:生化实验同组学生姓名:一、实验目的和要求（必填）三、实验材料与试剂（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）七、实验结果与分析（必填）二、实验内容和原理（必填）四、实验器材与仪器（必填）六、实验数据记录和处理八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习Folin■酚法测定蛋口质含量的原理和方法；2、常握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量;装3、

2、掌握分光光度计的使用方法。"4、掌握酶活力测定的基木原理和方法；汁5、学习酶的比活力的计算。二、实验基本原理Folin-m测定法是在双缩腺反应的基础上发展起來的，Folim酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件卜•蛋口质屮的肽键与酒右酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钳酸和磷餌酸、硫酸、澡等组成，在碱性条件下，铜•蛋£1质络合物以及蛋口质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸述原磷钳酸■磷鹤酸试剂（乙试剂）产牛深蓝色（钳蓝和鹄蓝的混合物），其

3、色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05〜O.5g/L.优点：简单、迅速、灵散度高；反应较稳定。缺点：该反应受多种因素的干扰。蔗糖酶（B・D■咲喃型果糖昔■果糖水解酶EC3.2.1.26）,是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2—糖苜键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和杲糖（还原糖）。因此，每水解lmol蔗糖，就能生成2mol述原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊—索模吉（Nelson・Smogyi）试剂比色法，斐林试剂法等。木实验采用3.5—

4、二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成止比。因此可利用分光光度计在500nm进行比色测定，求得样品屮的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。蔗糖酶活力单位（U）：蔗糖酶在室温（50°C）,pH4.5的条件下，每分钟水解产生1umol葡萄糖所需的酶量（ml）。蔗糖酶比活力的计算:酶的比活力——为每毫克蛋白质所具冇的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力

5、在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂屮单-位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。比活力一一酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含冇的酶活力单位数。比活力=活力单位/mg蛋白三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶样品I、II、III、IV2、实验试剂蛋白含量测定：⑴标准蛋口质溶液：O.5g/L牛血清白蛋白（2）Folin・酚试剂①甲试剂②乙试剂酶活力检测①3,5-二硝基水杨酸试剂；甲液：溶解6.9g结晶

6、酚于15.2ml10%NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.卬，乙二溶液相混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7-10天以后使用。②lg/L葡萄糖标准溶液（葡萄糖相对分子量198.17）；③5%蔗糖溶液；④0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；四、实验器材与仪器1、试管及试管架；2、可见光分光光度计及lcm玻璃比色皿；3、恒温水浴（25°C、50°C

7、、100°C）；4、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；5、试管、试管架；6、移液管;7、微量移液器：20010、1000U1；五、实验操作方法和步骤（-）蛋白质含量测定1、制备Folin■酚法蛋口质标准曲线取6支试管，编号1—6,按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A520nm值）。试管号1234560.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馆水（ml）10.80.60.40.20Folin•酚试剂甲（ml）555555混匀，在室温（25U）下

8、静置10minFolin-酚试剂乙（ml）0.50.50.50.50.50.5混匀，在室温下静置20minAsoonin2.各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋口质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品I、II、III、IV的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋口质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋口质含量A500nm值在蛋口质含量标准曲线范围以内为宜。取13支试管，编号1〜13,按表2依次加入各种