浙大生化实验一

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1、专业：生物科学姓名：学号：日期：地点：装订线实验报告课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：成绩：__________________实验名称：蔗糖酶的提取及离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶实验类型：生化实验同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。2、学习离子交换层析的基本原理；3、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；4、学习蔗糖酶

2、活性检测的基本原理和方法。二、实验内容和原理1、酵母细胞破碎本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。3、离子交换层析6离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交

3、换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。4、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖

4、和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。三、实验材料与试剂1、实验材料市售干酵母粉10g/组，蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂1、石英砂；2、95%乙醇(-20℃）；3、DEAE-SepharoseFastFlow(弱碱性阴离子交换

5、剂)；4、20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液；5、20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液；6、0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；7、5%蔗糖溶液；8、3，5-二硝基水杨酸试剂四、实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；64、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱；7、制冰机；8、1.5ml离心管；9、－20℃冰箱；10、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）；11、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10

6、rpm)（1台/组）；12、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）；13、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；14、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组）；15、部分收集器及收集试管（1台/组）；16、铁架台、夹子（固定层析柱用）（1套/组）；17、－20℃冰箱；18、试管、试管架等。五、操作方法和实验步骤1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g，约3-5g石英砂放入研钵中直接干燥充分研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积30-40ml的20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊

7、状液体（研磨越彻底，释放出的蔗糖酶越多）；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟（这次离心分离掉酵母碎片和酵母），收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。2、热处理：将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液（由于蔗糖酶相对耐热，热处理能除去很多不耐热的杂蛋白），保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后，4℃，