家蚕败血病病原拮抗菌的鉴定与抑菌作用

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1、家蚕败血病病原拮抗菌的鉴定与抑菌作摘要从木论喀斯特森林保护区土壤中分离获得1株对家蚕败血病病原具有显著拮抗作用的菌株，并研究其对家蚕败血病的抑菌效果，以期为新型微生物农药的开发奠定基础。拮抗菌株的发酵产物对败血菌具有较强的拮抗作用，抑菌圈直径平均为22.60mm,抗菌发酵液最大稀释倍数可达60倍。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16SrDNA序列分析对其鉴定为Paenibacilluspolymyxa,命名为PaenibacilluspolymyxaHC2015o关键词:家蚕；败血病；拮抗菌；抑菌作用细菌、真菌、病毒分别为家蚕疾病的三大病原。家蚕败血病(Bacterial

2、septicemia)是很严重的细菌病害,目前主要以化学药品防治败血病。大量使用化学药品易导致环境污染并威胁人体健康，因此采用生物制品取代化学药品是大势所趋。筛选家蚕病原物拮抗菌对生态蚕业的发展具有重要意义。目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸岀，学者从土壤、水、植物体内筛选分离拮抗菌菌株，并证实其在生物防治、促进生物健康发育等多个方面具有利用价值然而，生物防治主要应用于植物病害，关于动物病害防治的研究鲜见报道。笔者所在课题组从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选岀1株对家蚕败血病病原具有显著拮抗作用的菌株，且其抑菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、家蚕病原菌败血菌、苏云金芽胞杆菌、黑霉菌、

3、大肠杆菌等多种动植物病原菌均有较强的拮抗作用。本试验检测了A-02菌株对家蚕败血病的拮抗作用”以期为新型蚕桑用微生物农药的开发提供依据。1材料与方法1.1材料家蚕败血菌(Bacterialsepticemia)由笔者所在实验室保存z家蚕败血病菌病原拮抗菌菌株从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选获得。1.2菌悬液制备及分离培养称取土壤10gz于灭菌硏钵中硏碎，将100mL无菌水加入灭菌硏钵，振荡10~20min,即为10-1的土壤悬液；静置5~10min，吸取上清液1mL,依次梯度稀释，分别配制10-2、10-3.10-4.10-5.10-6.10-7.10七等不同浓度的稀释液。

4、取0.1mL悬液均匀涂布于培养皿中，待表面干燥后，于28°C恒温培养箱中倒置培养4~5d,根据菌落的大小、形状、边缘形状、表面结构、光泽、透明度、颜色等微生物菌落特征挑出单菌落并编号。1.3拮抗性能的检测采用平板对峙法检测菌株拮抗，设置3个重复，于28°C下培养45de依据病原菌与拮抗菌之间的距离判断拮抗作用大小，保留拮抗效果优良的菌株。采用平板扩散法检测发酵液活性,利用PDA液体培养基，于28弋下培养16~24h,记录发酵液扩散形成抑菌圈的最大稀释倍数。筛选拮抗效果和发酵性能优良的菌株。1.4菌体形态特征及生理生化指标的测定菌体形态及最适pH值测定、过氧化氢酶试验、甲基红

5、试验、氧化酶试验、腺酶试验、D引瞰式验测试、淀粉水解、V.P试验及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇发酵试验均参照相关文献中的方法⑷进行。1.516SrDNA序列测定及其系统进化树的构建16SrDNA序列PCR测走以通用的27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.1492R5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,为引物，以提取的总DNA为模板。PCR技术扩增16SrDNA序列的反应程序为：94°C变性5min;94°C45s,56°C45s,72°C90sz30个循环;72艾延伸10minf4艾保存。扩增出16SrDNA后，采用1%琼脂糖凝胶电泳进

6、行分离，经DNA胶回收试剂盒纯化后，直接邮寄至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析，并筛选岀9株菌株16SrDNA的全序列，采用ClustalW软件构建系统进化树。2结果与分析2丄菌株的分离筛选□□经拮抗性能检测筛选到1株对家蚕病原菌（金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌）均有较强拮抗作用的菌株，编号为A-02o该菌株对败血病菌的抑制效果较强，抑菌圈直径平均为22.60mm,抗菌发酵液最大稀释倍数可达到60倍□□（图1）。由表1可知，A-02菌株及其发酵液对败血病菌、苏云金杆菌的拮抗作用最强，对金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌也有一定拮抗

7、作用;发酵液稀释40〜60倍时对上述病原菌的拮抗作用仍明显，可见该菌株的发酵性能良好。2.2拮抗菌培养形态特征及革兰氏染色结果A-02菌株在PDA培养平板上生长的菌落特征为乳白色菌落、有光泽、菌落光滑、半透明。A-02菌株革兰氏染色为阳性；芽胞为椭圆型z菌体形态为杆状，芽抱、细胞壁革兰氏染色均为阳性。2.3生雄化特征A-02菌株为好氧菌，可于厌氧条件下生长。菌体受pH值影响不大z在pH值5~9区间培养抑菌效果良好（图2）。不能利用天门冬素培养基作为氮源,可利用无机氮源。A-02株过氧化氢酶试验有气泡产生，为阳性；甲