牙鲆出血性败血病病原的初步研究

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2、纯化,人工感染和生理生化测定.认为变异傲球菌为牙鲆出血性败血病的病原菌.苗体为圆形或椭圆形.单个成对排列或成短链,四联及不规则的堆团.单个菌大小为o.5～1.8m.无鞭毛.不运动.无牙孢.无荚膜.革兰氏阳性,不抗酸.好氧苗,葡萄糖O—F试验为氧化型.测定的22种糖苷醇类中,仅葡萄糖,D_果糖,蔗糖,麦芽糖,甘油为好氧产酸,D_甘露糖弱产酸,且均不产气.氧化酶,过氧化氢酶阳性.硝酸盐还原,美兰还原为阳性.甲基红,V—P反应为阳性.能水解明胶,马尿酸钠.不能水解七叶苷,淀粉.不产生硫化氢,吲哚.不能利用柠檬酸盐,丙二酸盐.精氪酸双水解酶

3、,赖氪酸脱羧酶,鸟氪酸脱羧酶,脲酶阴性.卵磷脂酶,凝固酶阳性.不溶血.先锋霉紊,氟霉紊,青霉紊,红霉紊为该病原苗的敏感药物..关键词歪蟹,岜堡壁窒挛墨堂蔓堕{生应.祷敏釜中圉分类号$941.413牙鲆(Paralichthysolivaceus)YJ比目鱼类,属鲽形目,鲆科,牙鲆属,肉质细嫩,味道鲜美,经济价值较高.随着牙鲆养殖业的发展,牙鲆的疾病时有发生,台湾省,日本对牙鲆的腹水病,链球菌病,白点病,皮肤溃疡病,肠道白浊病已作报道[1],我国对牙鲆疾病的研究较薄弱.1993年7月,青岛黄岛电厂建安公司在水泥池中养殖的牙鲆发生了一种

4、流行病,病鱼的典型外部症状为皮下大面积弥漫性出血,上下颌,鳍基部出血发红,部分病鱼表皮局灶性水肿,糜烂,解剖后可见肠中无食,肝脏土黄色,有些病鱼肝脏上分布有不规则的出血点.该病流行水温在23℃左右,每天都有鱼死亡,累计死亡率达40～5o.本文对该病的病原进行了初步的研究1材料与方法1.1病鱼来源1993年7月取自青岛黄岛电厂建安公司渔场,共14尾.1.2细菌的分离,纯化及初步鉴定用70的酒精消毒病鱼体表,以无菌操作切开腹腔,分别取少量的心,肝,脾,肾组织划线接种于2216E培养基,海水肉膏培养基和E’s培养基(酵母膏3g,蛋白胨15

5、g,葡萄糖5g,氯化钠0.5g,磷酸二氢钾2.5g,琼脂2Og,蒸馏水l000mL,pH8.2～7.4,0.058MPa30min灭菌),于25℃恒温培养24h后,取典型菌落进一步纯化,直至获得纯培养后,移八斜面培养.另外对体表溃疡处采用同样的培养基进行病原菌的分离.1.3人工感染试验收稿日期1999—11—1210湛江海洋大学第2O卷用于人工感染的健康牙鲆体长6～10cm,暂养于玻璃钢橱内,连续充气,每天投饵,换水,当水温从11℃渐升至23℃时采用肌肉注射法进行人工感染试验,连续观察5d.将培养24h的7株典型细菌(4株杆菌,3株

6、球菌)用无菌生理盐水配成麦氏浊度3号管(McF3)浓度的菌液,对健康牙鲆进行肌肉注射,注射剂量为0.01mL,对照组用等量生理盐水在相同部位进行注射,每组4尾试验鱼.再取出现天然发病鱼典型症状的试验鱼,重新分离纯化病原菌,重复进行肌肉注射感染试验.1.4病原菌鉴定1.4.1彤态与染色特性采用压滴法观察活菌的形态和运动性.分别对培养24h,48h的致病菌进行单染,革兰氏染色,抗酸染色,鞭毛染色,荚膜染色,观察菌体的染色特性及形态.另将在E’s液体及琼脂培养基上培养16h的病原菌用2的磷钨酸缓冲液(pH=6.5)进行负染,干燥后用H70

7、00型透射电镜观察.1.4.2培养特性致病菌分别接种于2216E,海水肉膏,E’S培养基的斜面,平板及液体培养基中,观察其生长情况.1.4.3生理生化特性将从天然发病的牙鲆中分离的菌株及人工感染发病出现典型症状的牙鲆中分离的菌株按文献[4~63的方法进行测试.1.5药敏试验采用扩散法进行药敏试验,试验所用的药敏纸片由上海试剂厂生产,试验时保持培养基厚度,培养基表面干燥程度,菌液浓度及培养时间的一致性.2结果2.1细菌分离,纯化结果从14条患病鱼的内脏组织及体表病灶处分离纯化到细菌117株,根据平板培养菌落特征及菌体特征,可将117株

8、菌分为7类,其中杆菌4类,球菌2类,从每类菌中取一代表菌株进行人工感染试验(见表1).表1人工感染菌株的形态特征2.2人工感染试验结果对照组的鱼在注射当天体表分泌粘液,活动减弱,不摄食,次日即恢复正常,继续饲养观察无任何异常反应;注射