细胞谷氨酰胺酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文

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1、细胞谷氨酰胺酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞谷氨酰胺酶（glutaminase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的酶偶联反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原后吸光峰值的增高，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）谷氨酰胺酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景谷氨酰胺酶（glutaminase；EC3.5.1.2）是一种氨基酸水解酶（amidohydro

2、lase），将谷氨酰胺脱氨基（deaminating）转化为谷氨酸。其同工酶具有组织特异性：其功能在肝细胞中产生的氨，用于合成尿素；在肾小管上皮细胞中产生的氨通过氨离子分泌，调节肾的酸碱平衡；同时在胶质细胞（glialcell）和肠细胞中也有表达。谷氨酰胺酶在药物和食品工业方面应用广泛，例如调味品的生产和白血病治疗的药物等。基于底物谷氨酰胺在谷氨酰胺酶酶的作用下，转化为谷氨酸和氨气，进而在谷氨酸脱氢酶的催化下，伴随着氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidizednicotinamideadeninedinucleotide；NAD＋）转化为还原型烟酰胺腺嘌

3、呤二核苷酸（reducednicotinamideadeninedinucleotide；NADH），产生的吸光峰值的变化（340nm波长），来定量分析谷氨酰胺酶的活性。其酶偶联反应系统为：GlutaminaseGlutamine+H2O→glutamicacid+NH3GlutamicdehydrogenaseGlutamicacid+NAD＋→2-ketoglutarate+NADH+NH3产品内容清理液（ReagentA）120毫升裂解液（ReagentB）10毫升反应液（ReagentC）4毫升终止液（ReagentD）400微升缓冲液（Reag

4、entE）40毫升酶促液（ReagentF）800微升底物液（ReagentG）2毫升产品说明书1份4保存方式保存裂解液（ReagentB）、缓冲液（ReagentE）、酶促液（ReagentF）和底物液（ReagentG）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（ReagentG）避免光照；终止液（ReagentD）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育比色皿或96孔板：用于光度分析

5、的容器分光光度仪或酶标仪：用于光度分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（ReagentB）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）2．小心加入3毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面3．小心抽去清理液4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）5．加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g8．小心抽去上清液9

6、．加入500微升裂解液（ReagentB），充分混匀10．转移到预冷的1.5毫升离心管11．强力涡旋震荡15秒12．置于冰槽里孵育30分钟13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长340nm，并置零2．从－20℃冰

7、箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（ReagentG）避免光照4一、背景对照测定1．移取90微升反应液（ReagentC）到新的1.5毫升离心管2．加入10微升95℃预处理15分钟后再预冷的的待测样品（20微克蛋白），混匀3．在37℃温度下孵育30分钟4．加入10微升终止液（ReagentD），混匀5．置于冰槽里备用，标记为阴性反应液6．移取820微升缓冲液（ReagentE）到新的比色皿7．加入20微升酶促液（ReagentF）8．加入50微升底物液（ReagentG）9．上下倾倒数次，混匀10．在37℃温度下孵育3分钟11．加入110微升上述冰槽里

8、备用的阴性反应液12．在37℃温度下孵育30分钟13．即刻放进分光光度仪检测，此