《研究内容》word版

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1、天山雪莲质体果糖1，6-二磷酸醛缩酶家族基因在植物低温光合适应中的生理机制研究果糖1,6-二磷酸醛缩酶在植物多个碳代谢过程中都起到重要作用。从前期雪莲低温转录组中发现，雪莲叶绿体中存在多达7个FBA基因的转录本，远超已知的其它植物。推测它可能以不同低温特性的混合同工酶形式应对雪莲生境中巨大的日温差变化。为了研究它们在雪莲低温光适应中的功能，本项目通过敲除质体FBA基因的雪莲突变体和过表达雪莲FBA基因的冷敏感植物番茄，采用气体交换技术对比分析它们在光合最适温度的响应。通过对转基因番茄碳同化过程中主要关键酶的活性、中间代谢产物和碳水化合

2、物含量的动态变化检测，关联分析雪莲的FBAasec基因对不同低温下Calvin循环运转效率的影响。通过叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其对不同温度下的光合碳流量的控制效率。最后，通过转基因番茄间的两两互交，检验同工酶之间的协同效应和作用模式。天山雪莲；果糖1,6-二磷酸醛缩酶；同工酶；低温光适应；生理机制2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1项目的研究目的为了研究天山雪莲叶绿体定位的果糖1，6-

3、二磷酸醛缩酶家族（sikFBAs）同工酶的多样性在应对高山生境日周期巨大温差变化中的生理机制，本项目通过CRISPR/Cas9技术，创建敲除雪莲叶绿体定位的sikFBAs的雪莲突变体和CaMV35S启动子或雪莲自身启动子驱动的sikFBAs基因在冷敏感的番茄中表达。采用气体交换技术比较它们在光合最适温度的响应（shifttheoptimumtemperatureofphotosynthesis)。通过检测转基因番茄碳同化过程中起重要调控作用的关键酶的活性、Calvin循环中的中间代谢产物和光合产物淀粉和蔗糖含量的动态变化，关联分析不同

4、低温条件下，单个的雪莲sikFBAase酶对Calvin循环运行效率的影响。通过对叶绿体荧光和光合参数的测定，采用C3植物的光合数学模型，分析表达在番茄中雪莲不同FBAase同工酶在光合能量中的分配作用，评估其在不同温度下的光合碳流量的控制效率。在此基础上，通过转基因番茄的两两互交，检验雪莲sikFBAase同工酶间的协同效应和工作模式。本项目的研究对于揭示天山雪莲低温光合的生理机制和改良冷敏感作物的低温光合性能都具有重要的研究意义。2.2项目的研究内容2.2.1天山雪莲质体sikFBAs不同基因在低温光适应中表达模式分析2.2.1.

5、1在不同温光组合和不同时间处理下，对天山雪莲幼苗叶片sikFBAs基因进行研究，确定sikFBAs不同基因间的表达变化特性。2.2.1.2根据sikFBAs基因非保守核酸区段，用双子叶植物的pP1C.1、pP1C.5的CRISPR/Cas9载体配套载体，构建特异性的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体。2.2.1.3利用构建的sikFBAs基因的植物CRISPR/Cas9敲除载体，转化天山雪莲，利用PCR对转基因植株进行靶基因敲除检测，筛选已敲除目的基因的转基因突变植株，进行表型分析。2.2.2天山雪莲质体sikFB

6、As基因启动子的克隆和组织表达分析2.2.2.1通过反向PCR技术，克隆sikFBAs家族基因的启动子，利用生物信息学软件分析启动子序列。2.2.2.2用克隆的sikFBAs基因的启动子，构建sikFBAs基因启动子驱动GUS报告基因表达的融合植物表达载体。2.2.2.3用真空渗透法转化拟南芥，研究不同低温和不同时间处理下，拟南芥转基因株系PsikFBAs-GUS基因的温光响应和时空表达特性。2.2.3天山雪莲质位sikFBAs基因亚细胞定位分析和转基因植株的获得2.2.3.1构建组成型（CaMV35S启动子）驱动sikFBAs-GF

7、P融合植物表达载体，用基因枪轰击洋葱表皮，激光共聚焦观察基因的表达。2.2.3.1构建组成型（CaMV35S启动子）驱动sikFBAs基因植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化法，转化番茄，获得过表达目的基因的转基因植株。2.2.3.2用克隆的sikFBAs基因启动子和sikFBAs基因，构建自身启动子驱动的植物表达载体，根癌农杆菌介导转化番茄，获得可表达目标基因的转基因植株。2.2.4天山雪莲msikFBAs突变体蛋白质表达检测和最适低温光合温度的变化分析2.2.4.1根据sikFBAs蛋白氨基酸序列的可变区，寻找具有抗原表位的短肽，

8、用于多肽抗体的制备并测定效价。构建sikFBAs基因的表达载体，制备并纯化sikFBAs蛋白，利用Westernblot检测免疫蛋白的特异性。2.2.4.2对获得不同msikFBAs敲除的雪莲突变体和正常雪莲，用不同温度