细胞工程动物组织和细胞的培养

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1、第4节动物细胞培养一动物细胞培养类型(一)细胞原代培养1.取材分离·取出组织块放入小烧杯中，用尖嘴剪刀将组织块剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡盐水BSS），冲洗数次。·AdultEmbryoEgg取材分离DissectionEnzymeDigestionCellCultureFinelychoppedPrimaryExplantsFurtherdissectionifnecessaryOrganCulture2.组织消化：·是用酶法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。·将剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加人30～50倍体积的0.2

2、5％浓度胰蛋白酶；·消化：37℃水浴内消化30～60分钟。·过滤：如果大部分细胞已经分散，终止消化，以不锈钢筛过滤(100μm）滤除未被消化的组织块。·离心：8000rpm/min离心5分钟，弃上清液,沉淀为细胞。·漂洗；Hanks液漂洗两次，每次2～3分钟，加人营养液。3.细胞计数·细胞悬液制成后，需要计数悬液中细胞的浓度，通常以细胞个数／ml表示。检查方法如下：·1）在干净的离心管中加人数滴细胞悬液，再加人6.4％台盼蓝（trypanblue）1滴，混匀后静置2～3分钟；·2）将计数板（如图）平放在显微镜台上，在盖片边缘加人l～2滴染色的细

3、胞悬液，使之完全充满计数板与盖片间的空间，勿留气泡，勿使盖片漂浮；·3）显微镜下记录计数板四角四个大格中的细胞总数，原则是:染蓝的细胞不数（死细胞），无色的细胞计数（活细胞），一团细胞按一个细胞计数。·计数时要注意：·如果细胞团数超过10％，说明消化过程进行的不充分；·如果细胞数少于20-50个说明稀释的不当.(二)传代培养·当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展连片，占满器皿表面。·这时需要对其分离重新培养，这一操作过程称之为传代。·有80％～90%或刚刚全部汇合的细胞，是传代的理想时期。具体方法如下：1)吸出培养瓶内旧培养液；2）加人胰蛋白酶和

4、EDTA混合液盖满瓶底对细胞进行消化；3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去残留的消化液。4）加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度；5）重新接种培养Tissuecultureflasks·T-flasks·Petridishes(三)微载体培养（microcarrierculture)·1967年，VanWezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径为60-250μm的微珠。·最初使用的材料为二乙基氨基乙基－交联葡聚糖A－50·后经改进，用带不同基团的葡聚糖（dextran）交联成几种大分子，以利于细胞的贴

5、壁及生长。·目前使用的dextranI、Ⅱ、Ⅲ三种型号都属于交联葡聚糖为基质的微载体，每种微载体所带基团各不相同。微载体培养细胞的具体步骤1）选择合适的微载体类型●先用少量三种微载体做细胞培养试验，一定时间内计算细胞贴壁数量，比较细胞用量、微载体用量，以此选出适当的微载体。（2）浸泡水化及消毒·在玻璃容器中加人适量的微载体，加入磷酸缓冲液（PBS）浸泡3小时以上，轻轻搅动。·搅动速度50～70rpm／min为好。·高压蒸汽灭菌，（3）接种·根据细胞类型决定接种浓度，例如，人成纤维细胞的适宜接种浓度为10cells／微载体；非洲绿猴肾细胞（ver

6、o）为5cells／微载体。·接种要达到一定浓度，但过高也不利。培养中的搅拌转速：·提供均相培养环境·防止微载体集聚·促进汽液交换·30-120r/min（4）培养观察·显微镜直接观察微载体上细胞生长·将微载体上的细胞消化下来计数并计算其浓度:·取1ml均匀的培养细胞样品，待微载体沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。·加胰蛋白酶37℃消化15min，吸出消化液后加到培养液中，过滤分离微载体，离心弃上清夜，保留细胞沉淀；·加美蓝染液2ml，血球计数器计数，计算细胞浓度。（5）消化·传代培养或收获细胞均需使细胞脱离微载体，通常采用酶消化法。消化步骤：

7、·停止搅动，待微载体沉淀后，去净培养液，用含0.25％EDTA的PBS（pH6.7），按50～l00ml／g微载体量清洗微载体，弃EDTA-PBs。·加人胰蛋白酶一EDTA，37℃搅动消化15min·加人含10%血清的培养液，终止消化作用。（6）分离细胞·脱离微载体的细胞培养液放人容器，·离心沉淀微载体（400r／min，2分钟）收集细胞。·还可用过滤方法，采用直径100μm孔径的尼龙网、不锈钢网等可将细胞与微载体分离开。（7）传代培养·微载体上分离下来的细胞可进一步做微载体传代培养。·可在细胞脱离微载体后，转接细胞，加人一些新的微载体以增大培

8、养体积。·另一种放大培养方法：也可在微载体长满细胞后直接加人微载体,更换培养基。(四)微囊化培养（microcapsuleculture）·微囊是用一