基因工程技术概述

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1、基因工程技术第一章绪论1基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2基因工程要素：包括外源DNA；载体分子、工具酶和受体细胞等。3基因工程的研究内容：（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。（3）重组体的转化：将重组体（载体

2、）转入适当的受体细胞中。（4）重组体的培养:对转入重组子的受体细胞进行培养,以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中。(5）克隆的鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）（6）目的基因的表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。来源：主要来源于原核生物性质：内切酶，即在DNA分子内部制造切口的酶功能：自我保护细菌的限制修饰系统：限制，将侵入细菌的

3、外援DNA进行分解形成小片段；修饰，细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。二、限制性内切酶的类型Ⅰ型限制性内切酶、Ⅱ型限制性内切酶、Ⅲ型限制性内切酶1、Ⅱ类限制性内切酶的基本特性：（1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。（2）切割位点：识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。[1]粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端，分为5’端突出，和3

4、’端突出[2]粘性末端的意义：①连接便利：i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。②末端标记：A末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。③补平成平齐末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端[3]平齐末端（bluntend）：在识别序列的对称轴上同时切割[4]平齐末端的特点：连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连

5、接粘性末端与平齐末端连接的处理方法：ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。ⅱ）削除(平)法：利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端[5]同裂酶（Isoschizomer)：不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同②不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。[6]同尾酶(Isocaudamers）：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再

6、被原来的酶识别[7]限制酶的酶活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。①星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。②诱发星号（*）活性的原因：ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在[8]Ⅱs型限制性内切酶移动切割（shiftedcleavage):在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（3）Ⅱ型限制性内切酶

7、不具有甲基化功能：Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割：定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低3.Ⅲ类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）四、限制性内切酶酶解反应条件1.标准酶解体系的建立：一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。2酶解过程：配酶解体系、混

8、匀、反应终止、酶解结果鉴定第二节DNA连接酶一、定义：一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶二、特点：1.两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端，背景低，准确性高（2）T4噬菌体的连接酶，不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端2