db21t 1861.2-2010 水产生物种质检验技术规程 扩增片段长度多态性法

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1、ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T1861.2 —2010水产生物种质检验技术规程扩增片段长度多态性法AFLPproceduretodetectgermplasmforaquaculturespecies2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T1861.2 —2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：刘卫东、高祥刚、赫崇波、李云峰、李宏俊、鲍相渤。附录A

2、、B、C均为资料性附录。8DB21/T1861.2 —2010扩增片段长度多态性法     扩增片段长度多态性法1　范围本标准规定了水产生物扩增片段长度多态性分析（AFLP）的原理、试剂、仪器和设备、采样、分析步骤和数据运算方法。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.15-2008养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析3　术

3、语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.2基因型（Genotype）控制某一性状的基因组合。3.3座位（Locus）基因在染色体上所处的特定位置。3.4等位基因（Allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.5多态性位点百分率(PercentofPolymaorp

4、hicLoci，P)表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.6Nei’s基因多样性指数（GeneDiversity，H）随机选择基因间的非同一的概率。3.7遗传距离（GeneticDistance，D）8DB21/T1861.2 —2010用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们

5、之间的亲缘关系将越远。3.8Shannon多样性指数(Shannonindex，I)用来估算群落多样性的高低。3.9聚类分析（ClusterAnalysis）将研究对象分为相对同质的群组（clusters）的统计分析技术。1　原理扩增片段长度多态性法（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）的原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增，先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段，并与含有粘性末端的人工接头相连，形成酶切位点不同的限制性酶切片段，然后用与接头和位点相匹配的引物进

6、行预扩增，预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态。2　试剂5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇：分析纯。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸61.7g，EDTA7.44g，加超纯水到1L。5.6冰乙酸：分析纯。5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9蛋白酶K（20mg/mL）：生

7、化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.13硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16TaqDNA聚合酶（生化试剂，5U/mL）。5.17标准分子量Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）：分析纯。8DB21/T1861.2 —20105.21限制性内切酶：EcoRⅠ、MseⅠ。5.2220%变性凝胶储存液：丙稀酰胺38.6g，双丙稀酰胺1.34g

8、，尿素86g，20×TBE缓冲液10mL，加热溶解，超纯水定容到200mL后，用0.25μm的微孔滤膜抽滤，放置棕色瓶中4℃保存。5.23上样缓冲液：98％甲酰胺，10mMEDTA(pH8.0)，0.01％